1实验材料与方法

1.1供试材料和仪器

拟南芥种子野生型为WT，转基因型A2、A4、OE-26、OE-37共4个株系，由周口示范学院生命科学院生物学实验室提供。该拟南芥转基因为RBOH基因，该基因在逆境胁迫下，可通过促进信号分子活性氧（ROS）的产生来增强组织的抗逆性[6]。转基因拟南芥中两个株系分别为A2、A4和OE-26、OE-37，A2、A4为T-DNA插入法获得的突变体纯合株系，OE-26、OE-37为第三代超表达株系。实验采用1/2 MS培养基，实验所用 CuCL2为分析纯( 99.9%) ，用蒸馏水配制成浓度为1000 mg/L的母液（根据查阅相关文献，Cu2+浓度为2.0 mg/L时胁迫效果最为明显[1]）。超净工作台，高压蒸汽灭菌锅，光照培养箱，冰箱4°C，培养皿，移液枪，营养土（实验室提供），小花盆（高10cm），托盘，封口膜，酒精灯。

1.1.1培养基

配制1/2 MS培养基: 1.0 % 琼脂(w/v) 7g；蔗糖2g；pH 5.8；大量元素1.25 mL(单位mg/L)；铁盐1 mL；肌醇1 mL（10mg/mL）；CaCL2·2H2O 0.25 mL；甘氨酸（2 mg/L）100 uL；VB1(0.1 mg/L)1 uL；VB6（0.5 mg/L）50 uL；微量元素0.5 mL;烟酸（0.5 mg/L）; pH 5.7

1.2拟南芥种子处理与培养

挑选饱满完整的拟南芥种子，将选好的种子置于1.5 mL离心管内，取70%酒精1 mL冲洗一次，放置4 min。用移液枪吸取无菌水（已备好）1 mL冲击振荡冲洗3~4次，加2 %次氯酸钠1 mL（现用现配）放置10 min。然后1 mL无菌水冲洗5~6次，使干净的种子与水体积比1：1，开始点种到1/2MS培养基上。在无菌箱中将五种类型的拟南芥种子分别用修剪过枪头的移液枪将种子吸出，均匀的 涂于1/2MS培养基上，将涂好的培养皿封装后需春化3d在4°C冰箱中。将培养皿转移至光照培养箱中培养（温度21~23°C，光暗周期 16/8 h）培养1周观察拟南芥发芽情况[2]。将生长至4片叶左右的拟南芥幼苗移栽到盆栽营养土壤（由实验室提供）花盆中。

1.3盆栽生长和胁迫处理

在培养皿中挑选生长状态良好的野生型和转基因拟南芥幼苗，向每盆中分别移栽拟南芥10颗，处理组拟南芥五种株系分别种3盆，对照组拟南芥五种株系各种4盆，用保鲜膜将花盆封口以保持水分。将花盆置于同一温室光照培养（温度20~22°C，光暗周期 16/8 h），待拟南芥植株覆盖花盆（大约生长20 d）后，对处理组拟南芥进行重金属Cu胁迫处理，对照组和处理组置于同一条件下正常生长。Cu胁迫开始前，停止对拟南芥浇水2d，待花盆土壤略显干旱后进行胁迫实验[3]。胁迫保持处于每天同一时间，同样容量金属溶液胁迫处理。取稀释至2.0 mg/L CuCL2溶液30 mL，依次对处于同一生长环境的五个株系的拟南芥植株进行Cu2+胁迫处理，胁迫处理进行5d，每天同一时间段，同一容量的Cu2+胁迫，观察并记录拟南芥生长情况，直至实验组拟南芥相比对照组拟南芥发生明显变化为止[8]。

1.4生理生化指标测定

1.4.1拟南芥过氧化氢酶(CAT)活性的测定

分光光度法，CAT的活性可以通过测提取液吸光率的变化而得出。取干净新鲜的拟南芥叶片2g，置于洗净的研钵中，同时在研钵中放入少许石英砂，并加入5 mL pH7.5的磷酸缓冲液（2°C冰箱保存预冷）后在冰块上进行研磨。研磨叶片至匀浆后，将匀浆转入20 mL容量瓶，在研钵中加入适量磷酸缓冲液清洗，冲洗后倒入20 mL容量瓶定容。将溶液摇晃均匀，容量瓶放置15 min在2°C冰箱，高速冷冻离心机设置为4000 r/min，时间20 min，离心后上清液即为CAT粗提液[5]。CAT粗提液需保存在4°C冰箱中。将准备好的3支10mL试管贴标签，一支试管 标签为对照管，另外2支标签为处理管，按表1顺序加入试剂。依次测出对照组（野生型和转基因型）、实验组（野生型和转基因型）过氧化氢酶（CAT）活性的值。