摘要：目的 从12株单克隆抗体中筛选出阳性抗鼠PD-1抗体并从细胞水平验证其中和活性。方法 本实验通过竞争酶联免疫吸附和流式细胞术两种方法进行了鼠PD-1抗体的初筛和复筛，并用酶联免疫吸附技术对筛选出的抗体进行了中和活性的检测。结果 成功筛选出1株抗鼠PD-1抗体，此抗体能逆转PD-L1蛋白对鼠T淋巴细胞活化的抑制，增加鼠T淋巴细胞分泌干扰素- r（IFN- r）。结论 阳性抗鼠PD-1抗体有中和活性，此抗体有望为人类相关疾病的治疗作出贡献。

关键词：PD-1 ；Anti PD - 1；PD-L1； IFN- r

Screening the Mouse PD -1 Neutralizing Antibody

Abstract：The positive anti mouse PD - 1 antibodies was selected from 12 strains of monoclonal antibodies and neutralizing activity of anti mouse PD - 1 antibodies was detected by the methods of ELISA and FCM. Only one anti mouse PD - 1 antibody was selected successfully ,and this antibody had neutralizing activity, can reverse PD - L1 protein inhibition of mouse T lymphocyte activation, increased the mouse T lymphocyte secrete IFN – r. This antibody is expected to contribute to the treatment of related diseases.

Key words：PD-1 ；Anti PD – 1；PD-L1；IFN-r

目    录

摘  要 1

引言 1

1.实验材料 3

1.1细胞株 3

1.2实验仪器 3

1.3实验试剂 3

2. 实验方法 3

2.1竞争ELISA方法初步筛选 3

2.2流式细胞术方法再次筛选 4

2.3抗体的中和活性检测 4

3. 实验结果 6

3.1竞争ELISA筛选结果 6

3.2流式细胞术检测结果 7

3.3 PD-L1浓度摸索结果 10

3.4细胞增殖 2h检测结果 10

3.5 IFN-r的ELISA检测结果 11

讨论 12

参考文献 14

致谢 16

鼠PD-1中和抗体的筛选

引言

T细胞的活化是细胞介导的免疫应答中的重要一步。T细胞的活化主要表现在细胞增殖，并出现分化，由静止细胞转变为效应细胞并执行各项功能[1]。接受抗原刺激后，T细胞完全活化有赖于两种信号。①抗原呈递细胞(或靶细胞)表面主要组织相容性复合体( major histocompatibility complex, MHC)/抗原肽复合物与T细胞表面的 T细胞受体(T cell receptor, TCR)结合为刺激T细胞活化的第一信号。②抗原呈递细胞表面B7分子与T细胞表面CD28分子结合为刺激T细胞活化的第二信号[1]。T细胞的活化还有赖于多种细胞因子的参与。例如，活化的肿瘤抑制基因(APC)分泌白细胞介素1(IL-1)、IL-6，可促进静止T细胞表达IL-2受体，从而参与T细胞的激活；活化的T细胞本身也可分泌多种细胞因子，从而介导T细胞完全激活[2]。CD3作为与T细胞受体紧密联系在一起的辅助分子，是将TCR信号传入T细胞的不可缺少的分子。IL-2和T细胞表面的IL-2受体的产生是T细胞活化的重要标志。

程序性死亡受体-1(programmed death-1,PD-1)是T淋巴细胞膜表面表达的负性协同刺激分子，是一种重要的免疫抑制性受体，最早是在凋亡的T 细胞杂交瘤中得到的，因其参与细胞凋亡而得名[3]。在正常的机体中，PD-1 作为一种T淋巴细胞增殖的负性调节分子，对维持机体的的稳定性和提高人体的免疫耐受有着重要作用；而在肿瘤和病毒感染时，细胞PD-L1表达增多，与T淋巴细胞膜表面的PD-1 受体相互作用，能够抑制T淋巴细胞的活化、增殖及对肿瘤的杀伤作用，使其功能发生紊乱和枯竭[4-6]。PD-L1可在多种免疫细胞及多种肿瘤细胞中表达，广泛参与自身免疫性疾病、慢性感染和肿瘤免疫应答的调控。以PD-1为靶点的免疫治疗对抗肿瘤、抗病毒感染、抗自身免疫性疾病及器官移植等都有重大的意义。肿瘤细胞通过高度表达的PD-L1分子，与T淋巴细胞膜上的受体PD-1结合，传递负向调节信号，导致肿瘤抗原特异性T细胞的凋亡和免疫无能，使肿瘤细胞成功逃过机体的免疫监视和杀伤。因此，干预PD-1/PD-L1信号通路对多种疾病的诊断和治疗具有非常重要的价值。针对PD-1 的单克隆抗体能够阻断PD-1与其配体PD-L1的相互结合，而抗PD-L1 的单克隆抗体可阻断PD-L1与PD-1、CD80 的相互作用，从而部分恢复T 细胞的作用[7-9]。