传统的化学治疗药物的目标是减缓癌细胞增殖并杀死癌细胞，而新型的免疫药物的目标是消除癌细胞对机体免疫系统的防御，从而使免疫系统被激活，促使免疫系统更高效地杀死癌细胞。以PD-1抗体为基础和其他抗体药物或者小分子抑制剂联合使用的治疗也在不断尝试中。并且开始进行了与现有的治疗手段相结合，如联合化学治疗、靶向药物治疗以及放射性治疗等。但是，依然有许多问题需要解决，比如如何寻找出理想的可以预测疗效的生物标记物、探索不同的联合治疗模式、确定原发以及继发耐药性机制等等[10]。随着这些问题的一一解决，抗PD-1、抗PD-L1单克隆抗体在肺癌以及其他癌症的治疗中将会有更多的应用[11]。恶性黑色素瘤通过刺激机体免疫系统的抑制性受体从而改变原有的免疫反应,发生免疫逃逸。通过阻断 T 细胞抑制性受体，来阻断恶性黑色素瘤的发展，为抗黑色素瘤的免疫治疗提供了又一种方法[12]。正在研制的PD-1单克隆抗体、PD-L1 单克隆抗体药物在抗肿瘤临床试验中已经表现出了良好的治疗效果和相对较低的副作用[13]。本实验通过抗鼠PD-1抗体的研究，首先应用于动物实验，作用于动物模型上，进而探讨抗鼠PD-1抗体和其他抗体联和运用时的效果，希望能进一步转向人体治疗相关疾病。

1.实验材料

1.1细胞株

小鼠T淋巴细胞是小鼠脾脏经免疫磁珠分离技术得到。所用培养基为无酚红1640+10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)。

1.2实验仪器

生物安全柜；低速离心机；37℃培养箱；CO2培养箱（5％CO2,37℃）；MACS多用支架；MS分选柱；酶标仪；300目筛子；移液器；涡旋振荡器；96孔圆底细胞培养板；血细胞计数板等。

1.3实验试剂

小鼠干扰素-r（Mouse IFN-r）ELISA检测试剂盒（捕捉抗体、检测抗体、标准品、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素），小鼠免疫磁珠分离试剂盒，无酚红1640细胞培养基，PH 7.2-7.4 PBS，磁珠buffer（PBS+0.5％FBS+2mM EDTA），牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum，BSA)，胎牛血清，Wash Buffer，Block Buffer，Reagent Diluent，Substrate Solution，终止液，台盼蓝等。

2.实验方法

2.1竞争ELISA方法初步筛选

使用竞争酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immune Sorbent Assay, ELISA)方法，让PD-L1配体与下列12株单克隆抗体分别同时竞争PD-1受体，从中初步筛选出能与外源PD-1受体结合的抗体。先用2ug/mLmPDCD1-his100μL/well包被酶标板，4℃过夜。PBST200μL/ well洗涤2次。然后加封闭液PBS+2％BSA 200μL/well常温孵育1h。PBST200μL/well洗涤2次，依次加入Sample 1 12株待测抗体100μL/well、Sample 2 mCD274-Fc(MA08JL3001)-biotin 100μL/well，常温孵育2h。PBST200μL/well洗涤4次，加入酶标二抗100μL/well，常温孵育1h。PBST200μL/well洗涤4次，显色液100μL/well常温显色20min。最后加终止液2M/L浓H2SO450μL/well。室温中，30min内用酶标仪测波长570 nm，630nm处光吸收值（OD）值。根据OD值分别计算12株单克隆抗体与PD-1受体的竞争抑制率。

表1  12株单克隆抗体基本信息

样品名称 原始浓度(mg/mL)

mPDCD1-R001 1.03

mPDCD1-R005 0.66

mPDCD1-R007 0.87

mPDCD1-R008 0.15

mPDCD1-R009 0.72

mPDCD1-R011 0.39

mPDCD1-R012 0.95

mPDCD1-R057 0.83

mPDCD1-R064 0.56

mPDCD1-R067 0.22

mPDCD1-R069 0.72

mPDCD1-R077 0.56

2.2流式细胞术方法再次筛选

在表达有mPD-1基因的CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中分别加入经过初筛的上述12株单克隆抗体，4℃孵育10min，用PBS+1％BSA洗涤两次。然后加入PE标记的抗鼠FC二抗，4℃孵育10min，PBS+1％BSA洗涤两次。最后用流式细胞仪通过检测荧光强度和阳性百分率确定12株单克隆抗体与鼠T淋巴细胞表面的天然PD-1蛋白的结合率。