摘要：蓝藻是一类单细胞原核生物，生活在水中，能够进行光合作用。集胞藻(Synechocystis sp.)PCC6803是蓝藻的一种,整个基因组序列已经测序完成，由于集胞藻具有成熟的遗传操作系统,目前已成为研究蓝藻生命活动的模式生物。本实验以集胞藻6803（Synechocystis sp.strain PCC 6803）的整个基因组为模板，设计合适的引物，利用高保真的KAPA HIFI酶PCR克隆CO2浓缩机制相关的基因sll1685，利用Gateway克隆技术将sll1685构建到35ss-GW-3HA中得到植物双元表达载体35SS-sll1685-3xHA。经菌液PCR和测序检测，结果表明该载体构建成功。并将该载体转入农杆菌感受态GV3101,为进一步在植物中过表达该基因，研究该基因的功能奠定基础。

关键词：Gateway技术;集胞藻6803;植物表达载体

Synechocystis 6803 gene cloning and plant transformation vector

Abstract: Spirulina is a type of single-celled prokaryotes, live in water and capable of photosynthesis. Synechocystis (Synechocystis sp.) PCC6803 is a cyanobacteria, sequenced the entire genome sequence has been completed, since the Synechocystis genetic mature operating system, has become a research model organism life activity of cyanobacteria. In this experiment, Synechocystis 6803 (Synechocystis sp.strain PCC 6803) of the entire genome as a template and appropriate primers designed using high-fidelity PCR cloning enzyme KAPA HIFI CO2 concentrating mechanism related genes sll1685 using Gateway cloning technology to build sll1685 to 35ss-GW-3HA obtained plant expression vector 35SS-sll1685-3xHA. Bacteria detected by PCR and sequencing results show that the vector was successfully constructed. And the competent vector into Agrobacterium GV3101, further in plants overexpressing the gene, the gene function research foundation.

Keywords: Gateway technology;Synechocystis 6803;plant expression vector

目    录

摘要- 1 -

引言- 2 -

1.材料与方法- 3 -

1.1实验材料- 3 -

1.1.1菌株- 3 -

1.1.2质粒载体- 3 -

1.1.3酶和试剂- 3 -

1.1.3.1酶- 4 -

1.1.3.2抗生素- 4 -

1.1.3.3实验试剂- 4 -

1.1.3.4 引物..- 4 -

1.1.4菌株培养基.-4-

1.2仪器设备-5-

1.3实验方法- 5 -

1.3.1 KOD PCR扩增......- 5 -

1.3.1.1KOD PCR反应体系：总体系为50μl....- 5-

1.3.1.2 KOD PCR的温度设置..-5

1.3.2菌液PCR反应.- 6 -

1.3.3琼脂糖凝胶电泳- 7 -

1.3.4 KOD PCR产物纯化- 7 -

1.3.5 利用Gateway技术构建植物的入门载体和表达载体. - 7

1.3.5.1  BP反应.......-7

1.3.5.2  LR反应.......-7

1.3.6 大肠杆菌转化.- 8 -

1.3.7保菌- 8 -

1.3.8 质粒提取.......-8

2.结果与分析- 9 -

2.1 SIR1685基因的序列分析与基因克隆- 9-

2.2 入门载体的构建.......- 10-

2.3 表达载体的构建- 11 -

3.讨论- 13 -

4.结论- 15 -

参考文献- 14 -

致谢- 17-

集胞藻6803基因的克隆及植物转化载体的构建

引言

蓝藻是生活在水中，就像植物的微生物，在地球上的分布较为广泛，淡水和海水中都有其踪迹，属于最古老、最原始的一群植物[1]。蓝藻是地球上，或几乎绝对厌氧还原环境中，第一个捕获太阳能，吸收二氧化碳进行光合作用生成氧气、糖和其他有用的化合物的细菌，蓝藻的这种关键功能使它对地球上的其他生物包括自养生物、异养生物乃至人类的演化，均有着不可取代的重大意义[2]。蓝藻是原核生物，与真核生物显著的区别就是无核膜包裹的真正细胞核，故也不存在核膜和核仁结构。在电子显微镜下我们可以观察到蓝藻的细胞壁有4部分组成，其中，含量最高的是肽聚糖层。蓝藻细胞壁以内的整个结构称为原生质体，主要有周质和中心质组成，其中，中心质中含有DNA，是蓝藻进行转录和翻译的场所，周质中存在许多呈条状排列的扁平膜状的表面含有藻蓝蛋白、叶绿素a、藻红蛋白及一些黄色色素的光合作用片层，与光合作用有关[3]。