摘  要：植物体内有复杂的信号网络传递系统，促分裂原活化蛋白激酶( Mitogen-Activated  Protein Kinase，MAPK )级联反应是真核细胞信号传递系统中的重要组成部分,而MAPKs在番茄抗病及抗逆性中的重要作用尚不明确，有待深入研究。本研究主要对番茄基因SlMPK1序列进行分析，利用Gateway技术将其构建到载体 pDONR207中获得MPK1 Entry Clone。然后通过LR反应再将其编码区引入到含35s启动子的植物表达载体35ss-GW-3HA中，从而获得双元植物表达载体35ss-MPK1-3HA。经菌液PCR检测和测序鉴定后成功将其导入农杆菌中。该研究结果为进一步研究番茄基因SlMPK1的功能奠定了基础。

关键词：SlMPK1；Gateway技术；基因克隆；

Gene Cloning and Plant Transformation Vector Construction of Solanum lycopersicum MPK1

Abstract: Plants have complex signaling network, mitogen-，activated protein kinase (MAPK) cascade plays central role during signal transmission in eukaryotic cells. The function of most genes in MAPK cascade in tomato disease resistance process leaves unclear, in this study we cloned SlMPK1 gene from tomato cDNA, sequences of this gene were analyzed, further Gateway technique BP reaction was employed to for MPK1 entry clone construction with the donor vector pDNOR207. Then LR reaction was performed with destination vector 35ss-GW-3HA to generated plant expression vector 35ss-MPK1-3HA. The expression was confirmed by sequencing and  introduced into Agrobacterium strain Gv3101. This study provided material for functional analysis of SlMPK1.  

Key words: SlMPK1; gene cloning; Gateway;

目    录

摘  要 - 1 -

引言 - 2 -

1.材料和方法 - 3 -

1.1实验材料 - 3 -

1.1.1感受态细胞 - 3 -

1.1.2生化试剂和酶 - 3 -

1.2实验仪器 - 4 -

1.3实验方法 - 4 -

1.3.1 引物干粉稀释 - 4 -

1.3.2 PCR扩增 - 5 -

1.3.2.1菌液PCR - 5 -

1.3.3琼脂糖凝胶电泳检测 - 6 -

1.3.4 PCR产物纯化 - 6 -

1.3.5质粒的提取 - 6 -

1.3.6 BP反应构建入门载体 - 7 -

1.3.7 LR反应构建目的载体 - 8 -

1.3.8大肠杆菌热激转化 - 8 -

1.3.9 农杆菌热激转化 - 8 -

2.结果和分析 - 9 -

2.1 SlMPK1目的基因克隆 - 9 -

2.2 SlMPK1入门载体构建 - 9 -

2.3 SlMPK1表达载体构建 - 10 -

2.4农杆菌转化菌液检测 - 11 -

3.讨论总结 - 11 -

参考文献 - 13 -

致谢 - 15 -

番茄基因SlMPK1的克隆及植物转化载体的构建

引言

番茄是世界上栽培面积最大，最为普遍的果蔬之一，也是我国非常重要的经济作物，并且其栽培面积一直在不断的扩大。番茄的果实营养丰富，可以生吃，熟食，加工番茄酱等。但番茄生长过程中极易受白粉，黄萎等病害的影响。严重影响了番茄的经济效益。

以往研究发现MAPK级联途径参与植物的生长发育，细胞死亡等过程，MAP激酶几乎在所有真核生物中均有存在，它和其它各种激酶共同形成MAPKs级联通路[1-2]。MAPKs途径有不同的调控方式，如转录水平，磷酸化状态等，不同条件下会启动不同的调控方式[3]。目前对人们对于番茄MAPKs途径中各级联通路的调控方式研究很多，但具体机制和成分等信息尚不够清楚，MAPKs途径对番茄的抗性如何起作用，人们也不完全清楚。丝裂原活化蛋白激酶又被称为细胞外信号调节激酶(External signal- Regulated protein Kinase， ERK )，属于苏氨酸/丝氨酸类型的蛋白激酶，在进化上相对较为高度保守，是真核生物的信号传递网络中很重要的组成部分，在真核生物由细胞外向细胞内传递多种信号的过程中有很大的作用[4-7]。MAPKs途径是真核生物中存在的最为广泛的信号传导模式，MAPKs反应系统分为非常保守的三级结构至少由三类蛋白激酶组成，它们的构成依次是MAPKKK-MAPKK-MAPK，胞外的信号可借助MAPK级联途径，利用其中的各成分，依次发生磷酸化反应并将此作用传递到下游底物，从而调控细胞生长，发育和抗性等生理生化过程[3]。