摘要：蓝藻是一种光合生物,同时它也是古老的原核生物，不仅在植物进化上有重要地位,同时它也是能够用来利用的生物资源，除此之外它还是科研方面极其重要的基因资源。集胞藻6803(Synechocystissp.PCC6803)是一种蓝藻，它是单细胞的。Sll0834是来源于这种单细胞蓝藻里面的起光合作用的重要基因，其同源基因在蓝藻中普遍存在,目前对其在蓝藻中的生物学功能已知。本研究从集胞藻6803基因组中克隆Sll0834基因，利用Gateway技术，通过BP反应和LR反应，将该基因构建到35ss-GW-3HA载体中，得到用于植物转化的双元表达载体35ss-Sll0834-3xHA，并将构建的双元载体转入农杆菌，为转化高等植物拟南芥奠定基础。

关键词：集胞藻;Gateway克隆技术;基因克隆;构建载体

Cloning of 6803 Sll0834 Gene and Construction of Plant Transformation Vector

Abstract: Cyanobacteria are a photosynthetic organisms, also it is ancient prokaryote, not only in the evolution of plants have an important role. At the same time, it also can used to make use of biological resources, in addition ,it is scientific research extremely important gene resources. PCC 6803 (sp. 6803) is a kind of cyanobacteria, which is a single cell. Sll0834 is an important gene which is derived from the photosynthesis of the single cell cyanobacteria and its homologous genes are common in cyanobacteria. This study from Synechocystis PCC 6803 genome cloning gene Sll0834, using gateway technology, through BP and LR reactions, the gene construct to 35ss-GW-3HA vector, are used for the transformation of plant binary expression vector 35ss-Sll0834-3xHA and will build a binary vector into Agrobacterium, which settles the foundation for the transformation of the higher plant Arabidopsis thaliana.

Key words: SP；Gateway cloning；Gene cloning；Vector construction

目录

摘要 1

引言 2

1.材料与方法 4

1.1实验材料 4

1.1.1菌株 4

1.1.2质粒载体 4

1.1.3酶和试剂 4

1.2仪器设备 6

1.3实验方法 6

1.3.1KAPAHIFI高保真酶PCR反应 6

1.3.2检测PCR反应 6

1.3.3PCR产物纯化 7

1.3.4Gateway反应 7

1.3.5质粒提取 8

1.3.6大肠杆菌热激转化 9

1.3.7农杆菌转化 9

2.结果与分析 10

2.1Sll0834基因的PCR扩增 10

2.2BP反应后阳性克隆的鉴定 10

2.3LR反应后阳性克隆的鉴定 11

3.讨论 12

参考文献 13

致谢 16

集胞藻6803Sll0834基因的克隆及植物转化载体的构建

引言

光合作用是绿色植物进行对营养的摄入以获得其本身生长发育所需求的养分同时释放出氧气的过程。蓝藻是原核生物，为光合自养型。叶绿素a是一种光合色素,也是蓝藻进行光合作用的主要色素。它的光合作用通过Calvin循环，用来固定大气中的CO2,通过光合反应，最终释放出氧。但是，我们所生活的环境中，空气中氧气的含量所占比重较大，CO2含量所占比重较小，有时候不能很好的满足自身的生长。所以这些植物为了自身更好适应大气环境，在多年的自然界演变过程中，终于进化出了更好适应生存的CO2浓缩机制(CO2–concentratingmechanism，CCM),这套机制就是通过在细胞内积累很高浓度的CO2，这样就可以很大程度上把RubisCO的固碳效率给提高[1]。蓝藻细胞内含有形状像扁平囊状的类囊体，在类囊体膜上分布着进行光合作用和呼吸作用所必需的蛋白复合体。内共生起源假说认为，蓝藻应该是真核生物叶绿体的祖先。最近这些年来，人们对蓝藻的研究范围逐渐扩大，蓝藻的全基因组测序工作也紧张有序的进行，截至到现在，蓝藻的所有物种中，全部完成了基因组测序的已经达到了38个物种。集胞藻6803是一种结构较为简单、遗传背景也已十分清晰、生长周期较短的单细胞蓝藻。并且它的全基因组序列测定由日本Kazu-sa研究中心于1996完成[2]，蓝藻作为一种模式生物，常常被应用于在功能基因与光合作用等研究中。这次实验所需要用到的集胞藻PCC6803具有很强的自然转化能力，它的自然转化系统已经在分子生物学的研究和光合作用的机制研究中获得了广泛的应用[3]。集胞藻PCC6803能通过自然转化系统来吸收外源基因或DNA片段之后，可以经过与基因组DNA序列的同源重组基因来发生双交换，然后将外源基因片段导入到自身染色体中并进行了稳定的表达，并将其转化到相应的载体上，并在农杆菌中表达，进行植物载体的构建。