迄今为止，在植物表达载体的构建方面,实验室大多仍采用传统的方式来进行，但是随着Gateway克隆技术的出现，构建载体有了更好的方法。它是一种全新的通用型的构建载体的方法,这种技术是由Invitrogen公司承担开发,λ噬菌体的位点特异性重组原理其实就是这种技术的基础[4]。这项技术的核心是DNA片段的转移不在拘泥于单一的某一载体，它可以在不相同的克隆载体之间来进行转移了,更为难得的是，进行转移以后，而且能够保持基因的定位和阅读框架都不会发生改变[5]。植物表达载体的构建目前还大多停留在采用传统的酶切和连接方法，传酶切-连接技术如果按照传统的方法进行，它的要十分的求严格，并且还容易出现偏差，除此之外，酶切位点的寻找也是比较复杂的一项工作。因此成功率不高[6]。随着Gateway技术的出现，这些难题都一应而解了。因为此方法不仅操作起来比较简单，在经济方面，它的成本也较低，更为难得的是它的成功率还很高，在这种强大的优势驱使下，以后的实验室研究中，这项技术必定会备受推崇。Gateway克隆技术其实原理并不难，它只是在特异位点进行DNA重组的一项技术，它把各种载体的技术平台都整合到一块了，这样一来也就克服了构建载体的各种缺陷，这是传统的酶切与连接的方法所不能够做到的。它的优点远不止这些，能够将基因高效率的克隆到，一个或者是多个与和Gate-way克隆技术相兼容的载体系统中[7]。Gateway技术可以把刚刚进行过PCR扩增过的产物与供体载体中含重组位点的部分在相应的酶的作用下，经过BP反应来获得入门载体(entryclone)，入门载体一旦构建成功，它就具有了相应的灵活性，例如它可以和不同用途的目标载体在相应酶的用下，进行LR反应以期获得相应的表达载体，这就省去了传统的反应中可能用到的核酸内切酶和DNA连接酶。与其他的植物载体的构建的方法比较,Gateway技术具有很大优势，不仅操作上简便,而且它用时也较短，通用性很强,克隆的效率超过90%[8]，并且在此基础上，原来的基因的定位和基因的一些阅读框架基本上不会发生变化。其在中间载体以及表达载体的上面均含有ccdB基因，恰恰大肠杆菌DNA促旋酶的重新聚合就能够被ccdB蛋白阻碍，这种情况下一些载体上面携带有这些基因的话，那它就都不能在大肠杆菌中进行生长和繁殖了，所以只有发生了重组，然后正好又被目的基因片段给替换掉以后，宿主菌体的生长才能不受影响，载体构建过程中的假阳性发生在很大程度上因此而降低了[9]。因此,通过对比，我们很容易的能够发现，在表达载体构建方面，Gateway技术还是具有十分明显的优势的。

1.材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌株

大肠杆菌Trans5α感受态细胞从周口师范学院植物遗传与分子育种实验室得到的。

1.1.2质粒载体

蓝藻PCC6803基因组DNA是从周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室所获得的pDONR207是从周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室所获得的35ss-GW-3HA是从周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室所获得的

1.1.3酶和试剂

1.1.3.1酶

KAPAHIFI酶

2×PCRMix含loadingbuffer

BP酶、LR酶

1.1.3.2抗生素

Gentamycin(Sigma)

Spectinomycin(Sigma)

Rifampi(Sigma)

1.1.3.3引物

本实验使用的全部引物均有周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供（表1）。

图1引物序列及用途

引物序号 引物序列 引物用途

S-453 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCAAATAACTAACAAAATTC

含有attB接头扩增Sll0834基因

S-513 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCAAATAACTAACAAAATTC