P1 TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC 验证入门载体

P2 GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC

P3 CAATCCCACTATCCTTC 验证最终的表达载体

P4 GACACACGAAATAAAGTAATC

1.1.3.4生化试剂

75%乙醇、50%甘油、蒸馏水、LB培养基（表2）、琼脂、50×TAE缓冲液（表3）、高纯度质粒小量快速提取试剂盒购自艾德莱生物科技公司等。

表2LB培养基配方

试剂 含量

Tryptone 1%

Yeastextract 0.5%

NaCl 1%

将固体培养基里面加入1.5%的琼脂，然后在121℃高压灭菌锅中灭菌15min。

表350×TAE缓冲液配方

试剂 含量

Tris碱 242gNa2EDTA·2H2O 37.2g去离子水 800ml冰醋酸 57.1ml

加去离子水定容至1L。

1.2仪器设备

超净工作台、电子天平、100mL和50mL的容量瓶、培养皿、不同量程移液枪、-20℃冰箱、-4℃冰箱、37℃摇床、37℃恒温培养箱、恒温水浴锅、实验电泳仪，离心机等。

1.3实验方法

1.3.1KAPAHIFI高保真酶PCR反应

以扩增为目的，PCR反应体系(50μl)。

模板DNA 0.5μlPrimer1 3μlPrimer2 3μlKAPAHIFI酶 25μlddH2O 18.5μl

PCR反应的条件：

95℃高温变性3分钟,98℃高温变性20秒,然后下一步在60℃低温退火20秒,之后就是在72℃适温延伸30秒,整个过程扩增30个循环，延伸5min,最后在16℃保存。

1.3.2检测PCR反应

菌液PCR反应体系(15μl)。

2×Mix 7.5μlPrimer1 0.5μlPrimer2 0.5μl模板DNA 1μlddH2O 7μl

PCR反应的条件：

95℃预变性8分钟,95℃高温变性30秒,然后下一步在58℃低温退火30秒,接着下一步就是在72℃适温延伸1分钟,整个过程扩增34个循环，72℃延伸5分钟,最后在16℃保存。