1材料与方法

1.1材料

1.1.1土样采集

本实验分离筛选溶磷菌与固氮菌土壤样品采集于周口师范学院试验田，采集土壤深度为5～10cm，光合细菌的分离筛选所选取河泥样品来自于周口公园湖底，土壤样品用无菌塑料袋包好，在塑料袋外贴上标签，注明采样地、采样时间，备用。

1.1.2培养基

Ashby固体培养基：甘露醇10.0g，KH2PO40.2g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl0.2g，CaSO4·2H2O0.2g，CaCO35.0g，琼脂15.0g，去离子水1000mL，pH7.2

溶磷菌培养基：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO40.5g，KCl0.3g，MgSO4·7H2O0.3g，Ca3(PO4)210.0g，FeSO4·7H2O0.03g，MnSO4·4H2O0.03g，琼脂20.0g，去离子水1000mL，pH7.0～7.5

光合细菌分离培养基：NH4Cl1.0g，MgCl20.2g，酵母膏2.0g，NaCl2.0g，K2HPO40.5g，去离子水1000mL，琼脂20.0g，pH7.0～7.2

光合细菌液体培养基：乙酸钠2.0g，酵母膏2.0g，KH2PO40.5g，K2HPO40.5g，NH4Cl1.0g，MgSO40.5g，NaCl1.0g，去离子水1000mL，pH7.0～7.4

明胶液化试验培养基：蛋白胨5.0g，明胶130g，蒸馏水1000mL

淀粉水解试验YNA培养基：酵母膏5.0g，琼脂23.0g，1%(W/V)马铃薯淀粉，蒸馏水1000mL

糖产酸Dye培养基：NH4H2PO40.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl5.0g，酵母膏1.0g，溴百里酚蓝（1.6%乙醇溶液）1.5mL，蒸馏水1000mL，pH7.0

柠檬酸盐试验培养基：柠檬酸钠2.0g，NH4H2PO41.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl5.0g，琼脂15~20g，蒸馏水1000mL，溴百里酚蓝（1.6%乙醇溶液）1.5mL，pH6.8

VP实验培养液：蛋白胨5~9g，葡萄糖5g，K2HPO45g，蒸馏水1000mL

H2S试验培养基：NH4H2PO40.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl5.0g，酵母膏5.0g，胱氨酸0.1g，Na2SO40.5g，蛋白胨5.0g，蒸馏水1000mL

硝酸盐试验培养液：蛋白胨10g，KNO31g，蒸馏水1000mL

A液：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10%左右)150mL

B液：α-萘胺0.1g，蒸馏水20mL，稀醋酸(10%左右)150mL

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2

King培养基：蛋白胨20g，MgSO4·7H2O15g，K2HPO41.15g，丙三醇15mL，色氨酸0.1g（可加可不加）

CCM：甘露醇5.0g，蔗糖5.0g，乳酸0.5mL，MgSO4·7H2O0.2g，K2HPO40.8g，KH2PO40.2g，CaCl2·2H2O0.2g，NaCl0.1g，钼酸钠2.5mg，酵母膏0.1g，乙二胺四乙酸-铁钠盐4.0mL，琼脂20.0g，pH7.0，去离子水1000mL

注意：乙二胺四乙酸-铁钠盐，CaCl2·H2O，MgSO4·7H2O都含有重金属离子，需分开灭菌再混合，否则会产生沉淀。

比色液：浓H2SO430mL，FeCl34.5g，蒸馏水50mL

(本实验所用所有培养基和玻璃器皿均在121.0℃下高压灭菌20min)。

1.1.3仪器和设备

RQH-350人工气候培养箱郑州生元仪器有限公司

超凡型小容量恒温培养摇床SPH-100B上海世平实验设备有限公司

EG823MF3-NW00000024美的微波炉广东美的厨房电器制造有限公司

GZX-9240MBE电热恒温鼓风干燥箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂

SW-CJ-2FD洁净工作台上海博讯实业有限公司医疗设备厂

LDZX-50K立式压力蒸汽灭菌锅器上海申安医疗器械厂

1.2方法

1.2.1固氮菌、溶磷菌的分离纯化

称取10g土壤样品加入到盛有90mL液体培养液中，进行摇床培养，温度28℃，150r/min震荡富集培养48h。富集培养完成后，取菌悬液1mL于试管中，进行梯度稀释。取最后三个稀释度10-3，10-4，10-5的菌悬液0.1mL分别涂布于固体培养基中，倒置于培养箱中进行培养，温度为28℃，培养时间为5~7d。每个浓度3个重复。观察菌落的生长状况，挑取大且生长良好的菌落进行纯化，从而分离出单个的菌株，放置于4℃冷藏库中保存备用。

1.2.2光合细菌的分离纯化

将适量污泥加入光合细菌液体培养基进行富集培养，倒入灭菌的液体石蜡覆盖3-4cm，培养温度为30℃，2000-2500lx光照，培养时间为7-14d，颜色变红时，挑培养基内红色液膜和瓶壁上的菌株进行菌株分离，菌落长成后，通过四区划线法分离纯化出单菌株。