摘  要：促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号途径是高度保守的，普遍存在于包括酵母和哺乳动物在内的多种生物细胞中。本研究克隆番茄基因SlMPK2，利用Gateway技术将SlMPK2构建到35ss-GW-3HA中得到植物转化载体35ss-SlMPK2-3HA。经菌液PCR和测序检测，结果表明该载体构建成功。并将该载体转入农杆菌感受态GV3101为进一步在植物中过表达该基因，研究该基因的功能奠定基础。

关键词：番茄；SlMPK2；Gateway技术；植物转化载体

Gene Cloning and Plant Transformation Vector Construction of Solanum lycopersicum MPK2

Abstract: The MAPK signal pathway is highly conservative and ubiquitously exists in various species, from yeast to mammal cells. This study we cloned tomato gene SlMPK2 and constructed plant transformation vector (35ss-SlMPK2-3HA) by Gateway reaction with binary vector 35ss-GW-3HA. Bacterial culture PCR followed by sequencing analysis confirmed this constructer was successfully generated. Further this vector was introduced into agrobacterium strain GV3101 for plant transformation and functional analysis of this gene.

Keywords: Tomato; SlMPK2; Gateway technology; Plant transformation vector

目    录

摘  要 1

引言 1

1  材料和方法 2

1.1实验材料 2

1.1.1 菌株 2

1.1.2 质粒载体 2

1.1.3 酶和试剂 2

1.1.3.1 酶 2

1.1.3.2 抗生素 2

1.1.3.3 生化试剂 3

1.2 仪器设备 3

1.3实验方法 3

1.3.1 引物干粉稀释 3

1.3.2 PCR扩增 4

1.3.3 PCR产物纯化 5

1.3.4 BP反应 5

1.3.5 LR反应 5

1.3.6大肠杆菌热激转化及培养 6

1.3.7质粒的提取及检测 6

1.3.8农杆菌转化及培养 7

1.3.9 保菌 7

2  结果与分析 7

2.1 PCR产物电泳后结果及基因分析 7

2.2 BP反应后菌液PCR电泳及质粒电泳结果分析和入门载体的构建 8

2.3 LR反应后菌液PCR电泳及质粒电泳结果分析和植物转化载体的构建 9

2.4 转化农杆菌后的菌液PCR电泳结果及分析 10

3  讨论与结论 11

参考文献 13

致  谢 15

番茄基因SlMPK2的克隆及植物转化载体的构建

引言

促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）信号途径是高度保守的，在多种生物细胞中普遍存在；活化的促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）进入细胞核，可使许多底物蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化，将上游信号传递至下游应答分子[10]。这些蛋白质参与了调控细胞生长、发育、分化、凋亡和抵御氧化胁迫、低温、高热、紫外辐射、干旱及病原菌侵害等多种信号转导途径[9]。MAPK参与多种信号转导过程并在过程中起信号放大和传递的中枢作用[5]。

MAPK作为MAPK信号通路的一部分，通过使底物磷酸化参与MAPK信号通路。近年来，随着功能获得型突变体、功能缺失型突变体的获得以及一些新的技术的应用，进一步阐明了促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）级联反应在植物抗逆过程中发挥的作用，在植物中发现了大量的MAPKs，相关功能研究也较为深入；其中MAPK途径中的一些成分已经被验证参与ROS信号通路并且能够调控内环境的稳态，如MPK6通过过氧化氢酶1调控H2O2的代谢，MPK4参与ROS的代谢过程。此外，来自于甘蓝型油菜的两个新基因BnaMAPKKK18和BnaMAPKKK19可诱导类似过敏反应的细胞死亡[19]。大多研究验证了MAPK信号通路在植物抗逆方面的作用，对于植物抗病方面鲜有报道。

Gateway技术是一种克隆操作平台，不依赖限制性核酸内切酶，利用载体上存在的特异性重组位点和重组酶，通过BP反应把目的基因克隆到入门载体后，再进一步通过LR反应克隆到目标载体上，从而高效[7]、快速地构建植物转化载体。

本研究以番茄Micro-Tom（MT）的叶片CDNA为模板，克隆番茄基因SlMPK2，对该基因进行分析。为了进一步研究该基因的功能，利用Gateway技术将该基因构建到植物双元表达载体35ss-GW-3HA中，得到该基因的过表达载体35ss-SlMPK2-3HA。