1材料与方法

1.1实验材料

为对芝麻DGAT1蛋白进行工程化定向改造，首先确定芝麻DGAT1蛋白的系统进化位置。本研究涉及到实验材料主要包括芝麻和其它模式植物物种，例如拟南芥、水稻和杨树等36个植物。这些植物分别来源于藻类植物、苔藓类植物、蕨类植物、裸子植物、单子叶和双子叶被子植物。

1.2芝麻DGAT1基因的检索

直接下载拟南芥DGAT1蛋白序列，利用BLAST同源搜索在SinBase数据库中[11]检索AtDGAT1同源基因，没有获得芝麻的DGAT1基因。为获得DGAT1基因的编码区，以AtDGAT1基因在NCBI数据库中dbEST数据库中搜索芝麻的EST，利用DNAMAN[12]对这些EST进行组装，通过电子克隆手段获得芝麻DGAT1基因的全长。

1.3DGAT1蛋白序列的比对与进化分析

为探明芝麻DGAT1基因与其他植物DGAT1基因的亲缘关系，我们以芝麻与其他植物DGAT1蛋白序列为基础，通过EBI数据库中的内置在线工具ClustalOmega[13]对这些序列进行比对，比对结果被下载并保存为Clustal格式，将这个文件直接提交到phylogeny.fr平台[14]上的BioNJ工具，构建进化树。通过手工调整进化树的拓扑结构，最终利用MEGA工具[15]绘制相应的进化树图。

1.4芝麻DGAT1蛋白结构域特征与活性位点预测

为搞清楚芝麻DGAT1蛋白的酶活性位点，首先我们利用TMHMM工具[16]对这个蛋白的跨膜结构域进行了预测，同时也利用SMART工具[17]对功能结构域进行详细分析。进而，利用序列比对方式，对保守功能区域进行比对分析，主要针对保守区域内变异位点进行统计。如果变异位点存在使得DGAT1酶活性有所不同的话，那么这些位点将成为改造芝麻DGAT1蛋白酶活性的良好靶点，最后整理这些变异位点作为芝麻DGAT1酶活性的候选位点。

1.5芝麻DGAT1蛋白的定点改造与稳定性分析

以芝麻DGAT1酶活性的候选位点为出发点，将芝麻DGAT1相应的氨基酸突变为其它发现的变异氨基酸类型。将芝麻DGAT1未突变的蛋白认定为野生型，将突变后芝麻DGAT1蛋白认定为突变型，通过对比野生型芝麻DGAT1蛋白与一些列突变型芝麻DGAT1蛋白的稳定性，可以初步推测点突变对芝麻DGAT1酶活性的影响，也就是说这种定点改造对提高酶活性的效果。通过系列定点改造芝麻DGAT1蛋白的单点，筛选高酶活位点。

2结果与分析

2.1芝麻DGAT1基因的鉴定

众所周知，植物DGAT蛋白隶属于MBOAT基因超家族，是一种典型跨膜蛋白[18]。为了从芝麻中鉴定出DGAT1基因，我们以AtDGAT1基因为检索序列，在SinBase数据库中同源搜索芝麻相应的同源基因，结果显示，在芝麻SinBase数据库中并没有发现DGAT1基因存在，这可能是芝麻全基因组测序质量不高的缘由。此外，我们用同源搜索的方法在NCBI数据库中进行检索，结果显示，在NCBI中存在芝麻DGAT1蛋白的序列，为确证这个DGAT1就是芝麻DGAT基因，笔者进一步利用NCBI中的CDD工具对芝麻DGAT蛋白进行分析，结果显示：芝麻DGAT1蛋白属于MBOAT超级家族的一员，具有典型MBOAT功能结构域（图1），这说明我们获得的芝麻DGAT1基因就是目标基因，可进入下游的其他分析[14]。

图1芝麻DGAT1蛋白的典型结构域

2.2芝麻DGAT1基因的序列特征

为了进一步明确芝麻DGAT基因的结构特征，笔者对芝麻DGAT1基因的基因组DNA序列与芝麻DGAT1基因相关EST和cDNA序列进行比较分析[15]，结果显示：芝麻DGAT1均有两个不同转录本，其中一个转录本对应的基因结构包括16个外显子和15个内含子，这种结构特点在其他植物中也普遍存在；另一种转录本对应的基因结构为13个外显子和12个内含子，这种结构模式并不常见，在其他很多物种中均没有这种结构模式，这说明这种转录本很可能只存在于芝麻中，具有明显物种特异性(图2)。