摘要：IL-4是由T细胞产生的一种细胞因子，人的IL-4基因位于第 5 号染色体上，包括 4 个外显子和 3 个内含子，约 10 kb，能够刺激B细胞的活化、增殖、分化，还与B细胞以外的淋巴细胞有着密切的关系。本实验通过pcDNA3.1(-)-Fc-XL10菌株的活化，pcDNA3.1(-)-Fc质粒的提取，双酶切线性化pcDNA3.1(-)-Fc和IL-4片段，然后T4重组连接形成重组质粒，通过转化方法获得含有 IL-4-pcDNA3.1(-)-Fc重组质粒的菌株，通过菌落PCR，提取重组质粒进行酶切鉴定以及测序的方法获得了含有重组质粒的阳性菌株，然后摇菌保存菌株。为表达出IL-4目的蛋白提供材料，用提取的IL-4蛋白免疫小鼠和家兔进行制备IL-4单,多克隆抗体。对制备获得的抗体进行多种检测，通过尝试应用制备IL-4抗体进行免疫组化进行研究。

关键词：IL-4；pcDNA3.1(-)-Fc质粒；IL-4-pcDNA3.1(-)-Fc重组质粒；原核表达

Construction of IL-4 gene prokaryotic expression vector

Abstract: IL-4 gene product is a cytokine produced by T cells, and human IL-4 gene is located on chromosome 5, including four exons and three introns, about 10 kb. This cytokine can stimulate B cells activation, proliferation, differentiation, and is closely related with the B-cell lymphocytes. In this study, pcDNA3.1 (-) - activating Fc-XL10 strain, pcDNA3.1 (-) - Fc plasmids were extracted, further digested as linearized pcDNA3.1 (-) - Fc fragment. IL-4 and pcDNA3.1 (-) - Fc fragment were connected to form a recombinant plasmid by T4 ligase. The IL-4-pcDNA3.1 transformate the strain, and the positive colony was determined by the PCR. At the same time, the recombinant plasmids were identified by restriction enzyme and sequencing methods, and then save shake bacteria strains. To express the IL-4 protein material provided with the extraction of IL-4 protein immunized mice and rabbits were prepared and IL-4 alone, polyclonal antibody. Antibody preparation was subjected to a variety of detection, immunohistochemistry studies prepared by attempting to use IL-4 antibody.

Key words: IL-4; pcDNA3.1 (-) - Fc plasmid; IL-4-pcDNA3.1 (-) - Fc recombinant plasmid; Prokaryotic expression

目    录

摘要 1

1引言 2

2实验材料 2

2.1 菌株和质粒载体 2

2.2 主要试剂及试剂盒 2

2.3主要仪器及耗材 3

2.4主要材料以及溶液的配制 3

2.5 引物 4

3技术路线 5

4IL-4-pcDNA3.1(-)-Fc质粒的构建 6

4.1 扩增出IL-4基因 6

4.1.1 进行PCR扩增IL-4 6

4.1.2 琼脂糖凝胶电泳 6

4.1.3 琼脂糖凝胶回收试剂盒回收DNA 6

4.2 pcDNA3.1(-)-Fc质粒的提取 7

4.3BamHI和XhoI 1 双酶切 pcDNA3.1(-)-Fc载体 8

4.4Xhol 1和BamHI双酶切 IL-4片段 8

4.5体外连接双酶切后的 pcDNA3.1(-)-Fc和IL-4基因片段 9

5重组质粒的转化 9

5.1 感受态细胞的制备（2×TSS） 9

5.2转化（热激法） 10

5.3 菌落PCR检测 10

5.4提取阳性克隆菌质粒双酶切鉴定 11

5.4.1 试剂盒法提取IL-4-pcDNA3.1(-)-Fc重组质粒 11

5.4.2 酶切鉴定 11

5.5 序列鉴定 12

5.6 含有IL-4-pcDNA3.1(-)-Fc重组质粒菌落的保存 12

6实验结果与分析 12

6.1IL-4基因PCR扩增结果 12

6.2 IL-4基因胶回收结果 13

6.3 菌落PCR检测结果 13

6.4IL-4-pcDNA3.1(-)-Fc重组质粒双酶切检测结果 14

6.5重组质粒测序结果 15

7讨论与结论 18

参考文献 19

致 谢 22

IL-4基因原核表达载体的构建

1引言

随着我国老龄化加剧、生态环境遭受破坏等问题的突显，不健康生活方式及垃圾食品的盛行，目前在我国肿瘤、过敏性疾病、类风湿关节炎、等疾病[1-6]发病率多年连续上升，已成为必须高度重视的社会问题。同时这些疾病的发生发展大多是由于免疫功能遭到损坏[7-10]。白细胞介素拥有着各种各样作用，在免疫反应中扮演着重要的功能，因此目前很多免疫学家及生物学家都致力于白细胞介素（interleukin，IL）的研究[11-13]。其中由T细胞产生的一种细胞因子白细胞介素IL-4（interleukin，IL-4），它能够刺激B细胞的活化、增殖、分化,还与B细胞以外的淋巴细胞有着密切的关系，广受研究者的探究[14-17]。