摘  要：集胞藻 6803是一种光合自养原核生物，环境适应能力较强，进行遗传实验操作比较便利，能够进行光自养生长和异养生长，是第一个完成全基因组测序的光合生物。生活周期短，培养方法简便并且花费较少，适合于测定多种生理指标，是研究光合作用的一种理想模式实验材料。此次研究主要是将蓝藻的CCM途径的相关基因Sll0030进行克隆，利用Gateway技术来构建植物转化载体，再将其转化高等植物体以期提高其光合作用效率。

关键字:集胞藻6803；CCM途径；构建载体；Gateway技术

Cloning of Synechocystissp PCC6803 Gene and Construction of Plant Transformation Vector

Abstract:Synechocystis 6803 is a photoautotrophic prokaryotes, and adapt to the environment ability, genetic experiment operation more convenient, capable of photoautotrophic and heterotrophic growth, is the first complete genome sequencing of photosynthetic organisms.Life cycle is short, the training method is simple and the cost is less, it is suitable for the determination of a variety of physiological indexes, it is a kind of ideal model experimental material for studying photosynthesis.This study is mainly related genes Sll0030 cyanobacteria CCM pathway cloning, the use of Gateway technology to build plant transformation vector, and then transformed into higher plants in order to improve the efficiency of its photosynthesis.

  Key Words: SynechocystisspPCC6803; CCM Pathway; Construction Carrier; Gateway Technology

目    录

摘  要： 1

引言 1

1.材料与方法 2

1.1实验材料 2

1.1.1菌株 2

1.1.2质粒载体 2

1.1.3酶和试剂 2

1.2仪器设备 4

1.3实验方法 4

1.3.1 KAPA HIFI高保真酶PCR反应 4

1.3.2 PCR产物纯化 5

1.3.3检测PCR反应 5

1.3.4 Gateway技术 6

1.3.5大肠杆菌转化 6

1.3.6质粒提取 7

2.结果与分析 7

2.1 集胞藻6803Sll0030基因的序列分析 8

2.2 Sll0030基因的克隆 8

2.3 入门载体的构建 9

2.4植物双元表达载体的构建 10

3.讨论 11

参考文献 13

致谢 14

集胞藻6803Sll0030基因的克隆及植物转化载体的构建

引言

集胞藻6803的培养条件比较简单、基因组小、不产生有毒害物质等特点,适合光合实验方面的操作[1-3]。所以，集胞藻6803是一种比较好的模式实验材料。蓝藻能进行放氧型光合作用，无论是个体结构还是种群结构，都对外界刺激反应非常敏感。它的生长周期很短，在适宜的条件下培养，细胞倍增的时间仅仅需要几个小时，因此很方便进行各种试验的操作和分析[4]。随着蓝藻基因工程的发展,蓝藻的一些优良基因被导入到植物中去改良和提升农作物的产量或者品质或者将外源基因导入到蓝藻中。在参考和查阅资料后了解到集胞藻中的高效固碳结构是羧酶体,它在CO2的浓缩机制(CO2-concentrating mechanism,CCM)中发挥着非常重要的作用。在集胞藻中,羧酶体中的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)和碳酸酐酶(Carbonic anhydrase,CA),HCO3–在胞质中通过这两种酶积累,通过增加RubisCO周围的CO2浓度的方式来提高光合作用中的固碳效率[5-7]。本研究将集胞藻的CCM途径的基因导入到C3植物中，在基因的表达载体的构建以及表达方面，了解到传统方法在目的载体的构建方面存在着缺点，所以利用Gateway技术来构建载体。根据Gateway技术的要求，设计特异引物，利用高保真的KAPA HIFI酶PCR克隆Sll0030目的基因，获得带有attB位点的目的基因。通过BP 反应将含有attB接头的PCR产物克隆到含有attP接头的pDONR207载体上以产生Entry克隆，即入门载体Sll0030 entry clone，再通过LR反应将入门载体Sll0030 entry clone的Sll0030基因克隆到35ss-GW-3HA载体上构建成植物双元表达载体35ss-Sll0030-3xHA，为目的基因的快速表达提供了一个高效率的载体，解决了传统载体构建过程中酶切连接的弊端，而且大幅度的提高了它的准确性[8-9]。利用Gateway技术来进行载体的构建，此方法在本次研究中主要是将蓝藻的CCM途径的基因进行克隆，构建载体，再将其导入到植物体内进行基因的表达检测[10]。如果检测到其成功表达将很大程度上提高C3植物的光合作用效率，从而提高其产量或品质。所以此种方法是可行的。将其导入C3植物后再检测其是否能表达，或者表达后的品质如何。此方法成功后为进一步应用于农业的生产中，为提高作物的产量和品质奠定基础。