1.材料与方法

1.1实验材料

1.1.1菌株

大肠杆菌Trans5α感受态细胞和农杆菌GV3101感受态细胞均由周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供。

1.1.2质粒载体

集胞藻6803二氧化碳浓缩机制相关基因组DNA 、pDONR207、35ss-GW-3HA均由周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供

1.1.3酶和试剂  

酶KAPA HIFI DNA聚合酶(KAPA BIOSYTEMS)2×Taq PCR StarMix with loading Dye(Genstar)

BP酶LR酶抗生素

   kanamycin(Sigma)

Gentamycin(Sigma)

Spectinomycin(Sigma)

Rifampicin(Sigma)

   引物

本实验使用的全部引物均由周口师范学院植物遗传与分子育种重点实验室提供（表1）。

表1引物序列及用途

引物序号 引物序列 引物用途

P1 GGGG  ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC ATGAAAAATGCCACCCTCCAC

含有attB接头扩增Sll0030目的基因

P2 GGGG  ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTc AAAAATTTGGGCAATGGA

P3 TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC

验证入门载体

P4 GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC

P5 ACAATCCCACTATCCTTC 验证最终表达载体

P6 GACACACGAAATAAAGTAATC

生化试剂及配方

75%乙醇、50%甘油、蒸馏水、LB培养基（表2）、琼脂、50×TAE缓冲液（表3）等。

表2  LB培养基配方

试剂 含量

Tryptone 1%

Yeast extract 0.5%

NaCl 1%

固体培养基加入1.5%琼脂，121℃灭菌15min。

表3  50×TAE缓冲液配方

试剂 含量

Tris碱 242 g

Na2EDTA·2H2O 37.2 g

去离子水， 800ml

冰醋酸 57.1 ml

加去离子水定容至 1 L。

1.2仪器设备

培养皿、移液枪、恒温水浴锅、离心机、精密电子天平、高压蒸汽灭菌锅、37℃摇床、64℃烘箱、超净工作台、50mL的容量瓶、移液枪、电泳仪、-20℃冰箱、-80℃冰箱、37℃培养箱等。

1.3实验方法

1.3.1 KAPA HIFI高保真酶PCR反应

以扩增为目的，PCR反应体系(50μl)

模板DNA 0.5μl

Primer1 3μl

Primer2 3μl

KAPA HIFI酶 25μl

ddH2O 18.5μl

PCR反应设定好时间和温度如下：

预变性 95℃ 3min

变性 98℃ 15s

退火 60℃ 20s

延伸 72℃ 1min

扩增 34个循环

终延伸 72℃ 5min

1.3.2 PCR产物纯化

PCR产物纯化的具体的操作步骤如下：

（1） ①PCR产物中加DD溶胶液200μl

     ②柱子中加100μl平衡液，离心2000r/min  0.5min

     将①加入②中离心12000 r/min  0.5min

（2）加WB容易漂洗600μl。离心1min（重复一次）

（3）倒掉管中液体然后放回柱子12000r/min   2min

（4）换为1.5mlEP管，开盖放在烘箱中1min，加入40μlEB(加在中间位置） ，盖上盖子放烘箱3-5min（孵化）

（5）拿出离心1min，扔掉柱子，产物放回冰箱。