摘要:番茄属于草本植物，它属于茄科，是茄科中的番茄属。本实验通过引物K-531、引物K-105以及番茄基因组为模板、酶和水，利用PCR技术，完成目的基因SlMPKK5的克隆，再通过Gateway技术，成功的完成植物转化载体的构建。Gateway这一核心技术，包括BP、LR两大反应。通过BP反应构建出了入门载体，LR反应完成表达载体的构建,然后经纯化后的质粒转化农杆菌Gv3101，为将该基因表达到植物拟南芥或番茄中，从而为进一步研究该基因的功能奠定基础。

关键词:SlMPKK5;PCR技术；载体构建；Gateway技术

Cloning and Analysis of Tomato Gene SlMPKK5 and Construction of its Expression Vector

Abstract: Tomato belongs to the herb, which belongs to the family.The primer K-531, primer K-105 and tomato genome as template, enzyme and water, by polymerase chain reaction (PCR) and cloning of target genes SlMPKK5, again by the gateway technology, the successful completed construction of plant transformation vector. Gateway is a core technology, including BP, LR two major reactions. Constructed the entry vector by BP reaction, and the LR reaction is completely expression the vector construction, then the purified plasmid transformation Agrobacterium Gv3101, for the expression of the gene to Arabidopsis and tomato in, so as to lay a foundation for further research on the function of this gene.

Key words: SlMPKK5; PCR technology；Vector construction; Gateway technology;

目录

摘要 1

引言 1

1.材料与方法 3

1.1实验材料 3

1.1.1菌株 3

1.1.2质粒载体 4

1.1.3酶和试剂 4

1.2仪器设备 5

1.3实验方法 5

1.3.1番茄基因SlMPKK5基因的克隆及分子操作 5

1.3.2Gateway技术 7

2.结果与分析 10

2.1PCR产物的序列分析 10

2.2BP反应后入门载体的构建及阳性检测 10

2.3LR反应表达载体的构建及阳性检测 11

3.讨论 12

参考文献 13

致谢 16

番茄基因SlMPKK5的克隆及植物转化载体的构建

引言

番茄是草本植物，它属于茄科，是茄科中的番茄属，主要类型有三类，分别为有限、半有限和无限生长型,在条件适宜的情况下，也可以进行多年的生长[1]。其发育周期包括幼苗期和结果期。番茄也是蔬菜的一种，它对温度要求比其它蔬菜要求较高，所以它是一种喜温性的蔬菜，同时由于它的光饱和点较高，通常大于一般作物对光的需求，故亦为喜光作物[2]。番茄的生长比较适宜短日照，在由它的生长过程分为两个过程，分别为营养生长和生殖生长，这两种生长过程在转化过程中，对光照的要求为短日照，但是对日照的要求也并不是十分的严格，番茄有不同的品种，它的有些品种即使在短日照下的情况下，可以提前出现开花现象，但番茄的大部分品种则在13小时左右的日照条件下开花较早，生长的植株也十分的健壮[3]。它是我国的重要经济作物，其栽培面积在不断的扩大。番茄的果实营养丰富，用途也十分的广泛，可以生着吃，熟着吃，工厂用于加工成番茄酱等[4]。另外，番茄也作为典型的C4植物，和C3植物相比，它的最大特点就是光合效率高。C4植物的叶肉细胞含量非常的丰富，在它的叶绿体中，在有关酶的催化作用下，磷酸烯醇式的丙酮酸的C3能够固定大气中的一个二氧化碳，从而C4就这样形成了[5]。它形成后，会进入叶绿体中，这个叶绿体是位于维管束鞘的细胞中，经过相应的反应后，它会释放出一个二氧化碳，并且形成丙酮。我们就把这种能够固定二氧化碳的酶，就称为磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，也就是我们称之的PEP羧化酶[6]。在C3途径中，有关的酶与二氧化碳的亲和能力已经算是很高了，但是在C4途径中，它本身所含的PEP的羧化酶与CO2的亲和力更高，约比前者这项途径高六十倍。在这些实验数据的强大说服力下，我们可以清楚的看到，在固定二氧化碳的能力方面，C4植物很高，并且要远远的高于C3植物。通常遇到干旱情况下，绿色植物处于对自身的保护，它的气孔往往是关闭的。这时，C4植物的优势就能很充分的发挥出来了，在叶片内细胞间隙中通常会有含量很低的二氧化碳，这时C4植物就能够利用这些低含量的二氧化碳，从而来进行光合作用，这是C3植物所不能的。之所以说前者比之于后者具有较强光合作用，它的原因之一就在于此了。我们知道，原核生物中含有羧酶体(Carboxysome)，它可以看作是原核生物的“细胞器”，它之所以会引起科学界的关注，究其原因是它本身因为参与固定二氧化碳及其进化生物学意义。羧酶体在蓝藻中也是极其重要的，它参与的在二氧化碳的浓缩机制（CCM）的运转过程中起关键作用,真核生物体内的淀粉核,及C4光合代谢机制和景天酸代谢机制等也存在CCM机制，但是目前C3植物的体内没有像蓝藻这样高效的CCM机制。本实验的最终研究目的是通过构建植物表达载体，将其导入到相应植物中。将番茄CCM途径基因导入C3植物中，提高光合作用碳反应效率，最终提高农作物的产量或品质。