摘要：本研究以野生型Solanumsitiens为转化受体材料。首先,构建外泌型重组人溶菌酶基因表达载体,采用叶盘法转化获得转基因阳性植株，采用生物胁迫和非生物胁迫,验证人溶菌酶的生物学活性与功能。利用实验室自建的瓶内检测体系，对同瓶内的野生型和转基因植株，分别接种植物病原菌（小麦赤霉孢菌、棉花枯萎病菌和茄病镰刀菌）进行生物学胁迫研究；另外，采用非生物胁迫（干旱、高盐、极限pH和极限温度）分析其表型和耐受能力差异。结果表明：在生物胁迫和干旱胁迫、高盐胁迫和极限温度胁迫下，转基因植株抗性明显增强，而在极限pH胁迫条件下，转基因植株抗性呈现减弱趋势。

关键词：人溶菌酶;Solanumsitiens;生物胁迫;非生物胁迫

The Functional Verification of Exosome Recombinant Human LYZ-OE in transgenic Solanum sitiens

Abstract: In this study, the wild-type Solanum sitiens was made as transformation acceptor material. Firstly, we constructed the extracellular secretory transformation vector of recombinant human LYZ, and the transgenic positive plants were obtained with leaf-disk transformation method, the biological activities and functions of human LYZ in S. sitiens were verified through biotic stress and abiotic stress systems. Meanwhile, The WT and transgenic plants in one bottle were simultaneously inoculated with plant pathogens (Gibberellic cinerea, Fusarium oxysporum and F. solani), and the biological stress verifications were made, under our innovative detection system in bottle. At the same time, we carried out abiotic stress (drought, high salt, extreme pH values and extreme temperatures) on the WT and transgenic plants, and the phenotype and tolerance differences were analyzed. The results showed the resistance of transgenic plants were increased significantly comparing to the WT under biotic stress and drought stress, high salt stress, extreme temperature stress, however, the transgenic plants showed the weaked resistance trend on extreme pH condition.

Key words: Human LYZ; Solanum sitiens; Biotic stress; Abiotic stress

目录

摘要 1

引言 2

1材料与方法 3

1.1材料 3

1.2实验方法 3

1.2.1培养基配制 3

1.2.2染色液配制 4

1.2.3无菌苗培养 4

1.2.4植株转化 4

1.2.5转基因阳性植株检测 4

1.2.6生物胁迫 5

1.2.7致病性分析 5

1.2.8非生物胁迫 5

1.2.9植物组织干鲜比测定 5

2结果与分析 6

2.1生物胁迫 6

2.1.1小麦赤霉孢菌互作 6

2.1.2棉花枯萎病菌互作 7

2.1.3茄病镰刀菌互作 8

2.2非生物胁迫 9

2.2.1极限温度胁迫 9

2.2.2干旱胁迫 11

2.2.3高盐胁迫 11

2.2.4极限pH胁迫 12

2.3植物组织干鲜比 14

3讨论 15

参考文献 17

致谢 19

外泌型重组人溶菌酶基因转化Solanumsitiens功能验证

引言

人溶菌酶（Lysozyme，LYZ）属于c型溶菌酶[1]，分子量大小约为14.7kDa，由130个氨基酸残基组成，结构内部含有4个二硫键。与其它来源的溶菌酶相比，人源溶菌酶高级结构与之具有很大的相似性，但是其一级结构之间具有很大的差异。人溶菌酶和目前临床上最常用的鸡蛋清溶菌酶相比，具有以下几点优势，如人溶菌酶来源于人体内，和人体自身具有天然的相容性，所以对人体来说，无毒副作用；人溶菌酶具有较高的热稳定性，其杀菌活性是鸡蛋清溶菌酶的3倍；人溶菌酶还具有抗病毒和抗肿瘤的作用。随着人们对人溶菌酶需求的增加，结构和功能的深入了解，其大规模生产和应用领域的研究也受到人们越来越多的重视。

番茄，茄科番茄属植物，是目前全世界栽培最为普遍的果菜之一，主要生产国是美国、意大利和中国。具有很高的营养价值，含有丰富的维生素C、维生素B和胡萝卜素，其维生素P的含量更是在所有蔬菜中居于首位。Solanumsitiens是茄属核桃叶茄系列中的类番茄茄，是目前所知茄属植物中与番茄遗传亲缘关系最近的野生近缘种[2]，同时也是一个濒临灭绝的物种，最早由Johnston于1929年发现。S.sitiens与栽培番茄一样具有黄色花瓣，果实成熟前为绿黄色，成熟后为黑色，自交不亲和，自花授粉。果实成熟后不久，就会立即失水干燥，且不会从植株上脱落。S.sitiens具有耐旱性、耐低温性、抗病性和抗虫性等优良农艺性状，并且具有其它生长在智利的番茄近缘野生种所不具有的宝贵基因资源，因此可用于改良现代栽培番茄果实的营养品质，或用于改良番茄抵抗病虫害的基因来源。