集胞藻6803 slr0012基因的克隆及植物转化载体的构建

引言

蓝藻，是最早出现在地球上的。又称蓝细菌（Blue-green algae），是一类具有革兰氏阴性菌特性并且是唯一可以进行光合自养的原核生物，大约有150个属，2000多种，它分布于海洋、内陆水体乃至荒漠、冰山、极地等极端环境，范围极为广泛并对环境有极强的适应性[1]。呈扁平囊状的类囊体存在于蓝藻细胞中，蓝藻细胞类囊体膜上有能进行光合作用和呼吸作用的蛋白复合体。内共生起源假说认为，真核生物叶绿体的祖先是蓝藻（Gould et al.2008）。随着蓝藻大规模全基因组测序工作的进行以及研究范围的扩大，到目前为止，已经有38个蓝藻物种（http：//genome.kazusa.or.jp/cyanobase）完成了基因组的测序。集胞藻Synechocystis sp.strain PCC6803（以下简称集胞藻6803）是一种能进行光自养生长，又能利用葡萄糖进行异氧生长的单细胞蓝藻。1996年，Kanekoetal等人是第一个完成了集胞藻6803全基因序列测定，但目前该藻株中许多基因的功能仍存未知[2]。成功测序的集胞藻6803基因组和集胞藻6803天然的遗传转化能力，大大推动了蓝藻功能基因组学的发展。目前，研究最多的是探究集胞藻6803中某未知基因的功能和它高效的利用CO2的光合作用的机理。Norling和Sato等人分别利用蛋白组学和酵母双杂交技术对集胞藻6803基因组的基因进行功能分析，目前已鉴定出部分基因的功能[3-4]。光合作用是生命科学研究中最重要的问题之一，随着粮食、能源和环境等问题的日益突出和严重，人与自然和谐相处和可持续发展的重要性被人们逐渐认识到，目前对光合作用研究的重要性也日益突出。研究表明，在碳限制的恒化培养条件下聚球藻细胞固定CO2的半饱和常数仅为3nmol.L-1[5],而对CO2具有高亲和力的蓝藻细胞的Rubisco的K0.5（CO2）大约是200-300μmol.L-1[6]。羧酶体(Carboxysome)是原核生物的“细胞器”，研究者不仅广泛关注它参与固定CO2的机理而且也极其关注它的进化生物学意义[7,8]。在蓝藻CO2浓缩机制（CO2 concentrating mechanisms，简称CCM）的运转过程中羧体起关键作用，细胞中绝大部分Rubisco位于羧体内，同时还含有CA[9-11]，其外为蛋白质鞘[12]。研究表明，CCM的作用机理是：外部环境无机碳（Ci）经跨质膜的碳泵泵入胞内，并以HCO3-形式在蓝藻胞内积累。积累在细胞质中的HCO3-经扩散进入羧体，后经碳酸酐酶（CA）催化脱水将HCO3-转化为CO2，从而引起Rubisco周围CO2浓度升高，一部分CO2被Rubisco固定进入卡尔文循环，生成PGA，依赖于光能的CO2转运途径部分回收剩下的向外扩散过程中的CO2 [5,12-14]。因Rubisco对CO2亲和力低，对O2敏感度高，故通过CCM途径增加Rubisco周围的CO2浓度可有效提高固碳效率。真核生物体内的淀粉核[15],及C4光合代谢机制和景天酸代谢机制[16]等也存在CCM机制，但是目前C3植物的体内没有像蓝藻这样高效的CCM机制。本研究从集胞藻6803中提取与CCM相关的基因Slr0012，构建植物双元表达载体，转入模式生物拟南芥中，检测该基因在拟南芥中的表达和拟南芥自身的光合作用碳反应效率是否得到提高，为农作物产量和品质的提高奠定了理论指导。

传统构建载体常用酶切连接的方法，但是这种方法不仅要对DNA进行切割、回收，而且效率较低，构建质粒载体不易成功。为了避免用酶切／连接技术构建表达载体所遇到的反复寻找酶切位点等问题，Invitrogen公司根据λ噬菌体基因组合大肠杆菌基因组之间的位点专一性重组分子机制开发了一套分子克隆新技术，即通路(Gateway)克隆技术[17]。利用Gateway技术构建载体方便快捷，省去了寻找酶切位点的麻烦也避免了连接时出现的问题。Gateway技术主要运用BP和LR同源重组反应来构建质粒载体[18]，①BP反应，使末端含有attB位点的PCR产物利用同源性重组的原理插入到含有attP位点的(pDONR vector) 供体载体中，可经反应后可获得含有attL位点的入门克隆载体（pENTR vector）。②LR反应，使入门载体中两端含有attL重组位点的目的基因DNA片段和含有attR位点的目的载体DNA分子发生重组反应可获得含有attB位点的表达载体（pEXPR）。其中，利用BP反应构建的入门克隆载体是Gateway技术的关键环节，主要是入门载体能与各种目的载体（pDEST）相兼容[19]。入门载体和目的载体又能通过LR反应构建含有目的基因的各种载体。目前，Gateway技术应用较为广泛，通常用于构建各种植物表达载体，如用于蛋白质亚细胞定位、组成型或诱导型表达目的基因、启动子分析、基因沉默、蛋白质／蛋白质相互作用等研究用的植物目的表达载体。本研究利用Gateway技术成功构建了植物双元表达载体35SS-slr0012-3×HA，对测序正确的菌液提取质粒，用琼脂糖凝胶电泳检测，条带正确的质粒使用热激法转入农杆菌（GV3101）中，最后利用农杆菌介导法转入模式植物拟南芥中。目前植物遗传转化的重要方法之一是农杆菌介导的转基因方法，农杆菌转化是将T-DNA随机地整合到目标植物受体细胞基因组中[20],利用农杆菌的双元表达载体系统能成功的将目的基因转到模式植物拟南芥中[21-22]，为进一步研究集胞藻6803 中CCM相关基因在植物体内的功能和是否能提高C3植物光合作用效率奠定了基础。