1 T4 PNK检测的荧光生物传感方法研究进展

1.1 基于磁性纳米颗粒的荧光法

图 1  基于AAP检测T4 PNK的原理示意图

Gao等[27]设计了一种新型的变构适配体探针（AAP）用于T4 PNK的简单检测。AAP由链霉亲和素（SA）的核酸适配体和其互补的DNA（cDNA）组成，它无需信号放大并在复杂的生物样品中具有最小干扰。当cDNA的5'羟基末端被T4 PNK磷酸化后，cDNA被lambda外切酶降解释放荧光素（FAM）标记的SA的适配体进而结合在SA微珠上。SA微珠上的荧光信号增强可以显微镜或流式细胞仪精确容易的检测到。本方法在复杂生物样品中表现良好这是由于信号分子在微珠上的富集以及丢弃背景干扰和未结合分子的简单操作。没有信号放大技术，本AAP方法不仅避免的复杂的操作而且减少了所需时间。

另外，Jiang课题组通过多功能的磁性探针和聚合切刻反应诱导的超分支滚环扩增（HRCA），研发了一种消除背景的荧光方法，此法可用于T4 PNK活性的灵敏检测[28]。这个方法显现出惊人的高灵敏都检测限达0.0436 mU/mL，并完成了细胞提取物中T4 PNK活性的超常表征，为生命科学和临床诊断提供了依据。

1.2 基于纳米材料特性的荧光法

唐波课题组基于磷酸化指导的纳米金（AuNP）猝灭荧光的恢复和Lambda外切酶（λ exo）调控的酶切反应首次证明了单分子检测PNK[29]。当PNK存在时，ATP的γ磷酸基团被转移到5'羟基末端，生成5'磷酸化的发夹探针。磷酸化的发夹探针可作为λ exo的底物并从发夹茎端移除5'单核苷酸，导致打开发夹结构和形成结合探针。生成的结合探针与AuNP表面修饰的捕获探针特异性杂交形成可做λ exo底物的带有5'磷酸基团的双链DNA，接着导致捕获探针的切割和Cy5分子以及结合探针的释放。通过基于全内反射荧光成像简单监测Cy5分子定量检测PNK的活性。这个方法极其灵敏，检测限可下探至9.77×10-8  U/μL，可进一步用于筛选PNK的抑制剂和检测癌细胞提取物中的PNK。

图 2  基于λ exo调控循环酶切诱导AuNP猝灭荧光恢复的单分子检测PNK的原理示意图

另外，Cen等[30]首次发现单链DNA和双链DNA在氧化氢氧化钴纳米片（CoOOH）上有明显不一样的吸附能力，基于此作者利用CoOOH的纳米探针和λ exo酶切构建的高灵敏的荧光法检测T4 PNK及其抑制。

1.3 基于核酸信号放大的荧光法

Zhang等[31]发表了利用λ exo辅助的纸基荧光检测方法的文章，检测PNK活性的方法主要通过监测纸表面的荧光强度变化来实现。Cy5标记的单链DNA（ssDNA）首先固定在醛基修饰的纸表面而标记有BHQ的ssDNA在适配ssDNA的帮助下用于猝灭Cy5标记ssDNA的荧光。当引入PNK和λ exo酶切反应后，纸表面的荧光猝灭效应被阻止了，这是因为磷酸化的dsDNA被相关的酶降解了。利用这个纸基的检测方法，PNK的活性在纯反应缓冲液和实际生物样中均能成功检测。该方法可实现检测大概50个细胞的裂解液。该方法同样调查了PNK活性的抑制作用，取得的结果令人满意。

图3  纸基荧光检测PNK活性的原理示意图  

Zhang等[32]利用磷酸化触发等温指数放大发展了一种简单非标记的荧光方法用于PNK活性的检测。该方法呈现超高灵敏度优于现存的大多数PNK检测方法。更重要的是，该方法能够在单细胞水平灵敏检测内源性的PNK活性，从而在临床诊断和生化研究上有巨大潜力。