二、研究的基本内容和拟解决的主要问题

（一）主要研究内容

1.克隆番茄LeOSCA1基因

使用重要经济作物番茄作为实验材料，根据已知的拟南芥同源基因的氨基酸序列进行生物信息学分析获取基因信息，采用Trizol法提取番茄叶片总RNA，用所取总RNA作模版，进行反转录，以反转录的cDNA为模版，进行RT-PCR扩增目的片段，得到其全长序列。所得片段进行电泳分析并转入大肠杆菌中提取质粒，质粒酶切鉴定后测序，得到目的基因LeOSCA1。再将LeOSCA1基因PCR产物进行鉴定及测序

2. 构建载体初步分析基因功能

1）构建目标基因35S启动子驱动的超表达载体、目标基因启动子驱动的 GUS 表达载体及 GFP 融合表达载体，拟为转化相应的番茄突变体或野生型奠定基础；

2）根据Unigene的注释信息或者基因结构域分析判断目标基因所在调控网路，初步探究番茄中该基因的可能功能和信号途径。

（二）拟解决的主要问题

1、目的基因片段的准确性。提取植物总RNA，用合适的引物逆转录得到cDNA，经PCR大量扩增目的基因，在目的基因与T载体连接后，送至公司测序。连上目的基因的T载体转化到大肠杆菌后要通过菌落PCR和酶切验证目的基因是否连接到载体上以及目的基因的序列是否正确，为保证后续实验的有效性。

2、载体构建：利用实验室的pGWB系统构建相关载体，扩增基因片段，连接到入门载体pENTR-1A上面，并通过LR反应连接到目的载体，分别是过表达载体（pGWB502Ω）和带有GUS标签载体（pGWB533）以及带有GFP标签载体（pGWB505）。

（三）论文框架结构

1.引言

2.材料与方法

2.1 材料

2.2 主要试剂和仪器

2.3 生物信息学分析

2.4 LeOSCA1基因的克隆

   2.4.1 扩增纯化LeOSCA1基因片段

     2.4.1.1 RNA提取

     2.4.1.2 反转录获取cDNA

     2.4.1.3 PCR扩增

   2.4.2 植物载体构建及验证

3.实验结果

3.1 基因的扩增

   3.2.1扩增LeOSCA1基因

   3.2.2 连接与转化

   3.2.3 菌液PCR鉴定

3.2 载体的构建

4.总结与讨论

5.参考文献

三、 研究方法及技术路线（拟采取的研究手段及技术路线、实验方案等）

（一） 研究方法

1. 番茄LeOSCA1基因的克隆

提取番茄叶片总RNA，反转录合成cDNA，再以cDNA为模板特异性扩增克隆LeOSCA1基因；

构建基因的克隆载体并进行验证；

2. 载体的构建

构建目标基因35S启动子驱动的超表达载体、目标基因启动子驱动的 GUS 表达载体及 GFP 融合表达载体，并进行验证。

（二） 技术路线（实验方案、撰写提纲）

（三） 可行性分析

1.该实验方法有较完善的理论基础，可通过大量文献资料查阅到；

2.实验室具备完好的相关设备，可操作性强；

3.个人已有一定的知识基础及实验操作能力。

四、研究工作的步骤与进度

（1）2018年8月：前期准备，查阅国内外相关文献，与老师讨论实验方法；

（2）2018年9月：进行实验工作准备，在导师指导下完成实验材料以及预处理准备；

（3）2018年12月：确定选题，提交开题报告；

（4）2018年11月—2019年3月：在导师的指导下进行LeOSCA1基因的克隆与初步分析且构建载体；

（5）2019年1-2月：进行毕业论文开题报告答辩，撰写综述和外文文献翻译；

（6）2019年2-4月：整理实验数据，撰写毕业论文；

（7）2019年4月：毕业论文答辩。

五、主要参考文献（作者、书名、论文题目、出版社或出版号、出版年月或出版期号。文科不得少于15篇，理科不得少于10篇，其中外文文献应不少于2篇）