bHLH(basic Helix-Loop-Helix)转录因子是由一个能与DNA结合的碱性区域和α螺旋1-环-α螺旋2组成的蛋白质，是真核生物转录因子中的一个大家族，对真核生物的生长代谢有着重要的调控作用。自1989年第一个bHLH蛋白被Murre等人从小鼠体中[4]鉴定出以来，它在真核生物各种生命活动中的功能不断被发现，已有的研究表明bHLH转录因子参与调控动物神经系统的发育[5]、肌细胞的生成[6]、性别的决定、植物生殖器官的形成和形态的发生[7]等。而在代谢方面，bHLH转录因子则可以调节萜类、黄酮类[8]、甾类、生物碱类、青霉素、血红素[9]等物质的合成。

对于该类转录因子的研究国内外学者正在积极的进行着，目前已有的研究成果主要集中在动物和植物群体中，相比于动物与植物，真菌体内bHLH型转录因子的研究仍然十分稀少，已有的研究也仅限于曲霉、酵母菌、白色念珠菌等一些常见的真菌。2012年Sailsbery等[9]对真菌体内bHLH转录因子进行了系统发育分析及分类，他们发现bHLH类转录因子参与调控真菌的性接合、性别发育与分化及气生菌丝的发育等。灵芝作为一种极具药用价值的大型真菌子实体，含有多种多样的活性成分，探究bHLH类转录因子对灵芝生长及生物合成的影响可以极大的造福于人类社会，应用于临床研究，具有广阔的研发前景。

本实验以bHLH型转录因子GL30684沉默菌株、空载体对照及其相应的野生型为研究对象，初步探究该类转录因子对灵芝菌丝生长、菌丝分叉及三萜含量的影响，以此辅助其他科研人员深入考察该类转录因子对灵芝表型生长及生物合成影响的内在机制，为研发灵芝作为保健品和药品等方面的研发和利用提供基础的理论依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 供试菌株

灵芝（G. lucidum）菌种G20由上海农科院提供，并由本实验室保存。

另注：WT为野生型，CK为空载体对照，30684i为沉默菌株。

1．1．2 培养基

PDA（1 L）：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g（固体：另20 g琼脂条）。

CYM（1 L）：麦芽糖10 g，葡萄糖20 g，酵母提取物2 g，蛋白胨2 g，MgSO4•7 H2O 0.5 g，KH2PO4 4.6 g，琼脂条20 g（固体：另20 g琼脂条）。

1．1．3 主要试剂及药品

95%乙醇、乙酸、高氯酸、荧光增白剂28、香草醛（0.5 g香兰素溶于10 mL冰醋酸）

1．1．4 主要仪器设备

28℃恒温培养箱、摇床、超净工作台、烘箱、激光共聚焦显微镜、高压蒸汽灭菌锅、天平、超声波清洗仪、台式高速离心机、恒温水浴锅、涡旋仪、722数显可见分光光度计等。

1．2 方法

1．2．1 菌种平板活化

取斜面培养基保存的母种，接种到PDA平板固体培养基上，倒置于28℃恒温培养箱黑暗培养至菌丝长满平板。

1．2．2 菌种发酵培养

将活化好的菌株用无菌打孔器打孔，转接5-7个菌块，到装有100 mL PDA液体培养基的250 mL锥形瓶中，150 r/min、28℃摇种5天。后使用匀浆机进行无菌破碎，以2.5 mL的接种量将GL30684沉默菌株、空载体对照CK和野生型WT种子分别接种到装有100 mL PDA液体培养基的250 mL锥形瓶中，150 r/min、28℃发酵培养7天。

1．2．3 菌丝生长速度测定

将活化好的GL30684沉默菌株、CK和WT用无菌打孔器打孔，取生长状态良好的菌块，接种到PDA固体培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中黑暗培养5天。后测量统计菌株直径。转化子、空载体对照和野生型均做三次重复。

1．2．4 菌丝生物量测定

将发酵7天的菌丝球用20目筛网收集起来，洗去表面的培养基成分，并全部平铺于滤纸上，放于60℃烘箱中烘干，后称重，记录菌丝生物量。转化子、空载体对照和野生型均做三次重复。