摘  要：本研究以棉花黄萎病致病菌-大丽轮枝菌为转化受体病原菌，在组培条件下对番茄MT接种大丽轮枝菌菌丝，使受体植株发病。选择发病中期叶片作为叶媒受体外植体，将pBI121质粒和转化介质以适当比例混合，采用真空抽提法对叶媒外植体进行抽提转化。转化后孵育1-2 d，于无菌条件下将其转移至MT无菌苗，使MT与大丽轮枝菌疑似转化菌株发病互作。取发病叶片进行GUS染色，蓝色菌株为转化成功阳性菌株。结果表明，以MT叶片为媒介，通过真空抽提的方法成功建立了大丽轮枝菌的农杆菌介导的叶媒法遗传转化体系。

关键词：大丽轮枝菌；叶媒法；遗传转化体系

The Transgenic system Construction of Verticillium dahlia using leaf-media method

Abstract: In this study, the pathogen of cotton verticillium wilt, Verticillium dahlia, was used as transgenic receptor pathogen, the MT was inoculated with V. dahliae under the condition of tissue culture, and the receptor plant was infected, then the infected leaf in the middle infected stage, was made as the leaf-medium. The plasmid pBI121 and transgenic medium vacuum pumping method. The treated leaf-mediums were incubated 1-2 d at 28℃ in darkness after , then were transferred to sterile MT seedlings, for MT infecting the suspected transgenic V. dahliae. At last, GUS staining was carried out on the detection of positive transgenic V. dahliae, so the blue strain was the positive strain. The results showed that the Agrobacterium-mediated transgenic system of V. dahlia, the MT leaves as media, was successfully constructed using vacuum pumping method.

Key words: Verticillium dahlise; Leaf-medium method; Transformation system

目    录

摘要 1

引言 1

1 材料与方法 3

1.1 材料 3

1.2 培养准备 3

1.2.1 番茄MT培养 3

1.2.2 大丽轮枝菌培养 3

1.2.3 质粒转化 3

1.3 方法 3

1.3.1 无菌苗获得 3

1.3.2 大丽轮枝菌活化 3

1.3.3 大丽轮枝菌与MT互作 3

1.3.4 pBI121质粒提取 4

1.3.5 转化操作 4

1.3.6 转基因阳性菌株检测 5

1.3.7 统计分析 5

2 结果与分析 5

2.1 质粒提取质量检测 5

2.2 大丽轮枝菌与MT互作 5

2.3 GUS染色检测 6

2.4 转化效率统计分析 6

3 讨论 7

3.1 质粒提取质量对转化效率的影响 7

3.2 抽提时间与次数对转化效率的影响 7

3.3 GUS染色时间对检测效果的影响 7

参考文献 9

致谢 12

大丽轮枝菌叶媒法遗传转化体系的构建

引言

大丽轮枝菌[1,2]是一类对植物具有严重破坏作用，并且分布极其广泛的病原菌[3]，曾在世界范围内流行。其在植物生长过程中会产生极大的破坏力，不仅影响植物的产量，而且影响产物的品质。目前，在轮枝属真菌中，已发现有6个致病性的菌种，其中真正的植物病原菌有两种，分别为大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）和黑白轮枝菌[3]（V. albo-atrum），它们属于同一个亚门-半知菌亚门（Deuteromycotina）。同时这两种菌也是引起棉花黄萎病的元凶[4]，棉花黄萎病严重影响棉花正常生长，降低其产量，被称为棉花界的癌症[5]。

大丽轮枝菌的最适温度为18-25℃，对恶劣环境有较强的抵抗能力。该菌种寄主范围非常广泛，对双子叶植物具有极强感染能力，据国内外报道一共可侵染600多种植物，包括大田作物番茄、茄子等，而通常的禾本科作物水稻、玉米、小麦等均不受其侵染。大丽轮枝菌可以在10-30℃条件下生长，生长环境与大多数植物相似，侵染植物的机会更大，因此影响多数植物的正常生长繁殖。

番茄[6]，茄科番茄属植物，是目前全世界栽培最为普遍的果菜之一，主要生产国是美国、意大利和中国。具有很高的营养价值，富含多种维生素，其维生素P的含量更是在所有蔬菜中居于首位。由于番茄具有美容、养颜、抗衰老、防氧和预防癌症等功效，一直受到消费者和广大科研人员的青睐。有限生长型番茄品种Micro-Tom（MT）是番茄中的一种突变体，是由Florida Basket和Ohio 4013-3杂交获得，其矮化基因来源于后者。初期被作为观赏类植物，后来由于其显著的特性被广泛研究。MT根系较为发达，但植株矮小，仅约10-20 cm，它的茎蔓结合紧密叶片较正常番茄种小，叶色也比较深。现在，MT被作为番茄遗传学[7]和功能基因组[8,9]研究的一个模型系统。作为一个模型系统，MT表现出的性状可媲美拟南芥，例如生命周期短，适合大规模诱变[10,11]和转基因植物生产[12]。此外，MT也是果蔬肉质果实发育研究的首选模式物种，同时也应用于到重要农作物[13]的研究。