传统转基因技术主要有传统的农杆菌转化法与基因枪法[14],广泛应用于植物和动物,近年来也有关于丝状真菌和酵母菌转基因的报道。农杆菌介导的遗传
传统转基因技术主要有传统的农杆菌转化法与基因枪法[14],广泛应用于植物和动物,近年来也有关于丝状真菌和酵母菌转基因的报道。农杆菌介导的遗传转化方法通常受农杆菌宿主专一性和受体材料的基因型限制,从而导致传统的农杆菌遗传转化方法[15]只适用于部分物种。因此,构建一种新型的、能够突破常规转基因技术瓶颈的、广谱的真菌遗传转化体系[16]显得格外必要。在本研究中,我们构建了农杆菌介导的叶媒法新型遗传转化体系,为真菌转基因技术的发展奠定了良好的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
番茄MT由实验室栽培、养护和保存。
大丽轮枝菌(生理小种编号:D08061)由本实验室保存。
1.2 培养准备
1.2.1 番茄MT培养
精选籽粒饱满的MT种子,培养于植物培养室。
1.2.2 大丽轮枝菌培养
挑取大丽轮枝菌(D08061)菌丝,接种于PDA培养基。
1.2.3 质粒转化
转化所用质粒为pBI121。
载体上具有多个基因克隆位点,其启动子是CaMV 35S,载体片段长度为14758 bp。载体标签:GUS,新霉素磷酸转移酶II基因(Neomycin phosphotransferase II Gene, NptII)。抗性基因为卡那霉素抗性基因(Kanamycin resistant gene, Kan),筛选标记为β-葡糖苷酸酶等。pBI121有良好的稳定性,且含有GUS基因,方便对转基因后材料筛选鉴定。
1.3 方法
1.3.1 无菌苗获得
在室外取幼嫩带有腋芽的MT茎段,小股水流缓缓冲洗约3 h。于超净工作台中,先使用75 %的乙醇对材料进行表面消毒30 s-1 min,然后用0.1 % HgCl2(滴加吐温20若干)消毒6-8 min,无菌水冲洗3-4次,插入MS培养基中,于光下培养。
1.3.2 大丽轮枝菌活化
挑取长势良好的大丽轮枝菌(D08061)菌丝,在超净工作台中,用灭过菌的竹签挑取菌丝于PDA培养基,置于培养箱中,25℃,倒扣培养。