1．2．5 菌丝分叉测定

将活化好的菌株用打孔器打孔，取生长状态良好的菌块，转接到PDA固体培养基上，倒置于28℃恒温培养箱中黑暗培养3天后，在菌丝的周围插上已经灭菌的盖玻片，继续培养。待菌丝长到盖玻片的中部时取出盖玻片，用酒精棉擦去菌丝较厚较多的地方，之后滴加2.5 µg/mL荧光增白剂28进行染色。然后将载玻片置于激光共聚焦显微镜的紫外光通道下，观察并拍照。

使用Image-Pro Plus 6.0软件处理拍到的照片，记录菌丝分叉之间的距离。转化子、空载体对照和野生型均做三次重复。

1．2．6 三萜含量测定

（1） 将发酵7天的菌丝球用20目筛网收集起来，洗去表面的培养基成分，置于60℃烘箱烘干，之后研磨成粉末状，干燥保存；

（2） 称取0.2 g的菌丝粉末于10 mL容量瓶中，用95%的乙醇定容，之后用超声清洗仪超声破壁120 min，中途每20 min震荡混匀一次，60 min时换水，以此获得最佳破壁效果；

（3） 取1 mL上清液于1.5 mL离心管中，4000 rpm 10 min离心后取400 µL上清样液于1.5 mL离心管中备用；

（4） 100 µL样液与200 µL香草醛及500 µL高氯酸混合于具塞透明玻璃管中，震荡混匀，加盖后60℃恒温水浴20 min，之后即刻冰浴10 min；

（5） 加入5 mL冰醋酸，用涡旋仪充分混匀，以95%乙醇为空白组，在550 nm下测量吸光值。每个样做三个重复。

1．2．7 数据统计分析

每组数据做三次平行实验，使用Adobe Photoshop CS6收集整理荧光图数据，用Excel收集整理数据，并用GraphPad Prism 6软件对实验数据进行多重比较和方差分析，并将数据转换成图表。

2 结果与分析

2．1 bHLH转录因子GL30684对灵芝菌丝生长的影响

本实验研究bHLH转录因子GL30684对灵芝菌丝生长的影响通过生长速度和生物量两个方面来考察。

2．1．1 对生长速度的影响

灵芝子实体的培养需要适宜的温度、光照时长、水分、空气等，不同的生长时期需要不同的培养条件，生长速度的快慢决定了灵芝子实体的形成周期，如若GL30684沉默菌株在其他方面的优势使其投入生产，本实验的研究可以成为探究与调整该类沉默菌株培养条件的参考基础，通过比较培养相同时间内野生型WT、空载体对照CK和30684i菌株的菌落直径大小，来体现不同菌株生长速度的差异，进而观察bHLH型转录因子GL30684基因的沉默对灵芝菌丝的生长所造成的影响