摘要：为了进一步研究发掘新的根瘤菌资源库，本文研究采用平板划线分离的方法从大豆根瘤中分离纯化根瘤菌，并且将获得的菌株进行盆栽回接实验，结果表明分离获得的大豆根瘤菌菌株均可在大豆和苜蓿上结瘤，具有结瘤能力。根据已公布大豆根瘤菌共同结瘤基因nod A、nif H、16S rDNA保守区域设计引物，并且对nod A、nif H、16S rDNA序列进行扩增分析和系统发育分析,由此鉴定本文中分离的根瘤菌为费式中华根瘤菌，从而在分子水平上实现了对大豆根瘤菌的快速鉴定。

关键词：大豆；根瘤菌；回接鉴定；共同结瘤基因

Isolation and Molecular Identification of Soybean Rhizobium

Abstract: In order to explore new rhizobium resource, the method of separating and purifying the root nodule bacteria from soybean root nodules was studied, and a pot experiment was carried out in this paper. The results showed that the isolated rhizobium of soybean could form nodules in soybean and alfalfa. According to the published soybean rhizobium common node tumor genes of nod A、nif H、16S rDNA, all the three genes were amplified. Phylogenetic analysis demonstrated that the strain isolated from Zhoukou was highly conserved with Sinorhizabium fredii of Germany, which convinced that rhizobium strain was S. fredii. The research provided the quick and accurate method for identification of soybean rhizobium at the molecular level.

Key Words: Soybean; Rhizobium; Re-inoculation and identification; Common nodulation gene

目    录

摘要 1

Abstract 1

引言 1

1材料和方法 3

1.1实验材料 3

1.1.1 菌株 3

1.1.2 培养基与试剂 3

1.2实验方法 3

1.2.1根瘤菌的分离和纯化 3

1.2.2根瘤菌的抗性鉴定 3

1.2.3根瘤菌的回接诱导根瘤 4

1.2.4根瘤菌总DNA提取 4

1.2.5 nod A、nif H、16S rDNA序列分析及系统发育分析 4

2结果和分析 5

2.1根瘤菌的分离鉴定 5

2.1.1表型鉴定 5

2.1.2根瘤菌的抗性分析 5

2.1.3回接实验的结瘤情况 6

2.1.4分子鉴定 7

2.1.5 nod A、nif H、16S rDNA的系统发育分析 7

3讨论 10

参考文献 11

致谢 13

大豆根瘤菌的分离与鉴定

引言

大豆（Glycine max L. Merrill）又名黄豆，它是一种含有丰富蛋白质的农作物，由于其营养价值的丰富，大豆常常用来做各种酿造酱油，榨取豆油、豆制品和提取蛋白质等。在2007年[1]，大豆年生产量是2亿2300万吨（MMT）约占所有豆科农作物的一半[2]。在过去的60年，大豆成为主要的油料作物。在2005年，美国农业部估计，世界大豆生产量是2亿1800万吨（MMT），约占56%全球油籽产量[3]。

根瘤菌(rhizobia)是一类与豆科植物共生，在其根部或者茎部形成根瘤并且固定空气中的氮气来为植物提供营养的一类革兰氏染色阴性杆状细菌，其作用机制主要是通过从植物的根毛侵入根内形成根瘤或者侵入茎部形成茎瘤，并且以共生体的形式固定空气中的N₂来为豆科植物提供可以利用吸收的NH4+。豆科植物的共生固氮体系发挥着非常重要的作用，尤其是在维持农作物生产力和维护半干旱土地的土壤肥力方面[4]。并且，固氮菌中高效有益菌的开发与应用可以大大提高半干旱土地的土壤肥力，而且还能减少长期过度使用化学肥料带来的环境和经济压力[5,6]。

根瘤菌需要特定的基因才能与豆科植物形成有效的共生。包括编码产生nod因子的nod基因，该基因能刺激植物产生共生节结、和固氮基因，从而产生固氮酶。nod基因是根瘤菌中一类独特的基因[7]，包括nod A、nod B和nod C，这些基因是根瘤形成的关键，这些基因参与了共生早期阶段，所有的三个基因是必需的，其中任何一个基因的突变，都会使菌株失去结瘤的能力[8]。