1.材料与方法

1.1实验材料

该实验所采用的是锦绣杜鹃植物叶片，均从周口师范学院校园内选取。采摘的是相对较为新鲜的叶片，带回实验室后，用清水洗去其表面污物，用滤纸吸干叶片表面的残留水渍，然后放到超净工作台进行风干。本试验采用单因素试验设计。

1.2实验试剂与药品

实验所用到的试剂与药品有：

新配好的2 X CTAB缓冲提取液:1 M Tris-Hcl、3.5 M Nacl、O.5 M EDTA ；

O.5 M EDTA : ddH2O, NaOH, Na2EDTA·2H2O，PH值调至8.0；1.0 M Tris-Hcl：Tris,ddH2O,浓Hcl，PH值调至8.5； 50 X TAE：Tris、冰乙酸、0.5 M EDTA；24:1氯仿异戊醇，异丙醇，乙醇，琼脂粉，核酸染料，buffer，marker等。这些试剂都是由周口师范学院提供。

1.3实验方法

本实验采用的是改良后的CTAB法【17-18】。CTAB法提取DNA是目前为止应用最多的一种方法，它的原理是利用CTAB(即十六烷基三甲基溴化胺）与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物从而使核酸释放。但是由于植物细胞中所含的成分复杂多样，比如说各种酶类，尤其是氧化酶类，还有糖类等，会对DNA的抽提产生很大的不良影响，因此，一些人通过改良CTAB法从而提高提取效果。

在这次的实验中，我们使用的是2XCTAB，250ml2XCTAB提取液配方：1M Tris-Hcl(PH8.5)25ml，0.5M EDTA(PH8.O)100ml，3.5M Nacl100ml,混匀后加5gCTAB溶解，定容至250ml。在2XCTAB抽提液中加入一点点PVP和2ul巯基乙醇，其目的就是为了防止褐化，防止植物细胞内的一些成分物质氧化成醌类，因为植物组织中富含多糖以及一些多酚类物质，对后续的实验研究非常不利。故改良的CTAB法能够有效地去除这些物质，并能在之后的各步离心中去除污染物。

1.4杜鹃属植物基因组DNA的制备

分别称取杜鹃属植物鲜嫩叶片（去叶脉）0.1g、0.2g、0.3g、0.4g，每个梯度称取4个，加入液氮在研钵中进行研磨捣碎，在快挥发完的时候放进适量的石英砂，快速研磨到粉状，使叶片研磨得更充分，将研磨好的样品分别装到2ml的离心管中，分别将离心管标记为A,A1，A2，A3；B,B1，B2，B3；C,C1，C2，C3；D,D1,D2，D3。在离心管中加入1ml的去糖buffer,放入10000r/min离心机中进行离心10min；去上清液，并在离心管中加入1ml经65℃预热的CTAB和2ul巯基乙醇，用力振荡，使其变得均匀。另外在CTAB中加入一点PVP可以防止褐化，但要注意适量，否则样品会变粘稠。充分混匀后，将装有样品的离心管放入浮漂中在恒温水浴锅中进行水浴:A,A1，A2，A3水浴2h；B,B1,B2,B3水浴3h；C,C1,C2,C3水浴4h；D,D1，D2，D3水浴5h。水浴期间摇晃3-5次，水浴温度约是65℃。

到时间后，将样品从水浴锅中取出冷却至室温，加入500ul氯仿异戊醇（24：1）轻轻混匀，摇晃15 min，于10000 r/min离心机中离心10min；用移液枪慢慢吸取上清液750ul到做好标记的2ml离心管中，加500ul氯仿异戊醇（24:1）轻轻混匀，摇晃10 min，于10000r/min离心机中离心10min；再取上清液500ul于1.5ml的离心管中，加入大约 2/3体积上清液的预冷异丙醇（450ul)，放进冰箱冷藏3个小时以上，此次样品均冷藏3个小时。

冷藏后，将样品取出于10000r/min离心机中离心10min,弃上清液，加入1000ul75%乙醇，振荡1-2min,之后与10000r/min离心机中离心5min；再弃上清液，加入1000ul75%乙醇，振荡1-2min,于10000r/min离心机中离心5min,最后把上清液倒掉，置于超净工作台干燥。干燥完全后加入30-50ulddH2O(去离子水）溶解DNA，可以放在-20℃冰箱内进行保存，以备下次使用。一般情况下，RNA不影响DNA的特性分析，所以我们可以不用除去样品中的RNA,如果想除去RNA,可以在提取出的DNA样品中加入2ul的RNA酶，这样就可以得到纯度更高的DNA。