1材料与方法

1.1供试昆虫

本实验所用的昆虫为二化螟，是2016-2017年采自江西南城的田间种群。供试种群参照韩兰芝等（2009）推荐的人工饲料配方进行室内饲养。饲养条件保持稳定：温度28℃±1℃,相对湿度70%±10 %，光周期16h：8h（L：D）。体重范围6-9mg的四龄中期幼虫为标准供试昆虫。

1.2主要试剂和仪器

1.2.1主要试剂

a) 总RNA提取试剂（TRIzol Reagent）购自上海Invitrogen公司；

b) TaKaRa LA Taq with GC Buffer、pMD™19-T Vector Cloning Kit均购自Takara宝生物工程（大连）有限公司；

c) M-MLV反转录（BioTeke supermoⅢ RT Kit）购自北京百泰克（BioTeke）生物技术有限公司；

d) IPTG、X-gal和Ampicillin购自北京索莱宝（Solarbio）科技有限公司；

e) DH5α Competent Cell购自北京康为世纪（cwbiotech）生物科技有限公司；

f) 凝胶回收试剂盒（E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit）购自美国OMEGA Bio-tek公司。

g) 2×Taq Master Mix (Dye Plus)、Marker等购自南京诺唯赞（Vazyme）生物科技有限公司

1.2.2主要仪器

微量移液器 德国Eppendorf

凝胶成像系统（VersaDoc MP 4000） 美国Bio-Rad

全自动样品快速研磨仪（Tissuelyser-48） 上海净信科技

紫外分光光度计（Nanodrop 1000） 美国Thermo Fisher Scientific

AllegraTM 64R 离心机 美国Beckman

Master cycler Nexus PCR仪 德国Eppendorf

水平式核酸电泳仪 北京市六一仪器厂

4℃/-20℃双门冰箱 德国西门子

-80℃冰箱 日本SANYO

RXZ智能型人工气候培养箱 宁波江南仪器厂

隔水式恒温培养箱 宁波江南仪器厂

Thermomixer comfort 德国Eppendorf

恒温水浴锅DK-8D 上海精宏实验设备有限公司

QYC-2102C小容量双层恒温摇床 宁波江南仪器厂

超净工作台 宁波江南仪器厂

1.3试验方法

1.3.1二化螟总RNA的提取及cDNA的合成

取20头二化螟成虫和若虫，加入1 mL TRIzol Reagent，用Tissuelyser将虫体磨碎，按照Invitrogen公司的TRIzol总RNA提取试剂盒说明书进行，然后使用紫外分光光度计（Thermo Nanodrop 1000）对所提取的RNA进行纯度及浓度测定，-70℃保存待用。

用于片段克隆的cDNA模板按照百泰克M-MLV反转录试剂盒中的说明书进行操作，得到的cDNA放置于-20℃保存待用。

1.3.2生物信息学分析及基因克隆

通过果蝇基因和基因组数据库Flybase获得黑腹果蝇已报道的pain基因的蛋白序列，然后将获得的蛋白序列与NCBI（National Center of Biotechnology Information，）中二化螟基因组数据库(Genbank accession numbers: AOSB00000000) 以及本实验室所测二化螟转录组数据库进行TBLSATN比对，获得二化螟pain基因的序列片段。依据上述分析所得的假定序列，使用软件 Primer premier 5.0 设计扩增全长引物： CsPainF：5′-AGAAACCACCAGATGCGATTGCAGC-3′ ， CsPainR ：5′-GTGGATCGCTCTTCGGCGCAGA-3′；然后利用NCBI在线引物设计网站（）对所设计引物序列进行验证评分。

基因克隆使用Takara公司的LA Taq® with GC Buffer试剂盒，并按照说明书进行操作，以二化螟幼虫cDNA为模板，用LATaq酶扩增CsPain。PCR 反应体系为：10×LA PCR BufferII（Mg2+ Plus）5 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1 each）8 μL，模板 cDNA 2 μL，F 引物（10 μmol·L-1） 2 μL，R引物（10 μmol·L-1） 2 μL，LA Taq（5 U·μL-1）0.5 μL，灭菌蒸馏水补足至 50 μL 体系。扩增反应条件为：94℃预变性 3 min；94℃变性30 s，50—55℃退火30 s，72℃延伸3 min， 35个循环；最后72℃延伸10 min。RCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行条带鉴定，并将正确的亮带进行割胶，然后使用OMEGA公司的胶回收试剂盒（E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit）并按照说明书对PCR产物进行回收纯化。将回收得到的目的基因连接到T载体，按照Takara公司的pMDTM 19-T Vector Cloning Kit说明书操作，连接体系如下：pMDTM 19-T Vector 1 μL，solutionI 2 μL，PCR产物2 μL。然后将连接有目的基因的质粒转入DH5α感受态细胞，并将转化后的DH5α细胞均匀涂布于含有LB培养基的平板中，倒置培养16h后进行蓝白斑筛选，挑取白斑进行菌液PCR，然后通过琼脂糖凝胶电泳对目的基因与T载体的连接效果进行鉴定，菌液PCR按照南京诺唯赞公司（Vazyme）的2×Taq Master Mix说明书进行操作，引物使用pUC系列质粒的通用引物M13F和M13R。将菌液PCR验证正确的菌落接入LB培养液并于37℃摇菌扩繁，然后将这些菌液送至南京擎科生物公司测序部进行测序。