摘  要：为获得更加稳定、高效、快捷和经济的融合蛋白亚细胞定位的方法，本研究拟建立一种质粒介导的新型瞬时转化方法。从洋葱内表皮细胞的质粒转化到基因表达镜检分析的最佳时间为48 h。在离体洋葱表皮细胞转化的最佳条件下，即渗透介质成分为糖I、盐III、缓冲液I和缓冲液II时，暗孵育时间为48 h，其转化效率最高，可达98.38 %。该方法在用时、设备要求、费用和转化效率等方面比传统瞬时转化方法如基因枪法等具有明显的优势，更适合进行大规模的蛋白质亚细胞定位分析。

关键词：离体洋葱；瞬时转化；质粒介导；亚细胞定位

The System Construction of a Novel In vitro Transient Transformation in Onion Epidermis

Abstract: The novel plasmid-mediated transient transformation was constructed in this study, for a stabilized, more efficient and economical method on analyzing fusion protein subcellular localization. The optimal time is 48 h from plasmid transformation to microscopic examination analysis after key-genes’ expression. The optimum incubating time is 48 h in the darkness, and the highest transformation efficiency is 98.38 % under the best transformation conditions, that is, the complete infiltration liquid was made as following: sugar I, salt III, buffer solution I and buffer solution II. There are more obvious advantages on time-consuming, equipment dependency, cost and transformation rate than the tradition methods, such as particle bombardment in onion epidermal cells. Meanwhile, this method is more convenient in the analysis of protein subcellular location on large scale.

Key word: In vitro onion; Transient Transformation; Plasmid-mediating; Subcellular localization

目    录

摘要 1

引言 1

1. 材料与方法 3

1.1 材料 3

1.2 培养基 3

1.3 转化方法 3

2. 结果与分析 5

2.1 单一成分对转化率的影响 7

2.2 不同组合对转化率的影响 8

2.3 不同暗孵育时间对转化率的影响 9

2.4 不同质粒对转化率的影响 10

3. 讨论 10

3.1 质粒介导的真空抽转瞬时转化 10

3.2 转化效率检验 11

4. 展望 11

参考文献 12

致谢 16

新型离体洋葱内表皮亚细胞定位体系的构建

   引言

洋葱，一种百合科葱属草本植物。长期以来被用作经典的实验材料，在分析植物细胞的结构，RNA和DNA的分布位置，植物组织中还原糖的测定[1]，核型分析[2]，蛋白亚细胞定位、相互作用等研究中。洋葱内表皮细胞呈单层排列，细胞透明，内色素物质代谢，无自发荧光噪点，在作为亚细胞定位受体系统进行分析荧光融合蛋白的亚细胞定位情况时不会产生干扰信号，能够更加精准地反映出所需观察的目的荧光信号的定位情况，以及蛋白-蛋白间的互作情况。

   定义蛋白质功能的一种重要工具就是亚细胞定位成像技术。荧光融合蛋白又是一种非常理想的非酶标记蛋白，蛋白亚细胞定位是一种具有许多明显优点的活细胞成像系统，如对细胞本身无毒性，具有稳定的荧光性质，活细胞可视化，容易观察，物种非特异性，没有基质的干扰信号和错误信号等。荧光融合蛋白的表达也常用于研究活细胞中蛋白-蛋白之间的相互作用、翻转、运输、转运和遗传[3]。研究表明，国内外研究者常采用农杆菌介导侵染法[4-6]，粒子基因枪轰击法[7,8]，原生质体转染法[9]等进行瞬时转化分析，已被用于分析水稻[10,11]、拟南芥[12,13]、玉米[14,15]、大豆[16-18]、土豆、番茄[19-21]等植物材料的功能基因和蛋白-蛋白间关系的研究分析。

然而，目前的大多数瞬时转化方法有一定的局限性，如对设备的依赖度较高，需要特殊的仪器设备（如激光共聚焦显微镜和基因枪等），制备过程复杂（需要配制多种转化所需药品如金粉悬浮液和进口盐类等），转换效率较低（一般情况下只有1-3 %左右）和需要辅助材料等。为了突破这些技术瓶颈，河南省作物分子育种与生物反应器重点实验室于2014年开发出了一种全新的农杆菌介导的快速检测荧光融合蛋白亚细胞定位的技术方法[22]，成果发表于当年的PLoS One期刊，该方法具有以下优点：1）快速。3-5 d可以得到最终实验结果。2）高效。单个基因的荧光融合蛋白定位率高达43.87 %。3）假阳性概率低。选用活体洋葱的内皮层细胞为受体细胞，转化介质的细胞毒性小，能准确呈现瞬时表达结果。4）费用低廉。实验中不需要特殊的仪器设备，如激光共聚焦显微镜和基因枪，不需要特殊药品，如金粉颗粒等。5）操作简单。无需制备植物细胞原生质体、悬浮细胞和材料离体孵育等。为了提高新型亚细胞定位技术的操作与工作效率，亟待开发和设计出一种更加高效的瞬时转化方法，大大缩短操作流程，提高转化的效率，加速科研的进程速度。我们希望新的转化方法与其他瞬时转化方法如原生质体转染拟南芥[34]、菠菜[33]和杨树[35]，农杆菌侵染拟南芥细胞和基因枪轰击洋葱细胞表皮等相比，能够克服上述诸多不足，并有助于进行大规模分析蛋白-蛋白和高通量分析的共定位关系等。