1. 材料与方法

1.1 材料

紫皮洋葱“红太阳”，一种常见的洋葱栽培品种。实验室经常用作亚细胞定位实验操作研究的受体研究材料。

1.2 培养基

1.2.1 材料孵育

转化后的洋葱内表皮需置于固体MS培养基上进行转化孵育，并添加1/1000（v/v=1：1000）的PPM用于制止杂菌。

1.2.2 渗透介质

1.3 转化方法

1.3.1 GFP/RFP融合蛋白构造

携带GFP基因的pSAT6-GFP-N1[23-26]载体由中国农业大学王涛教授馈赠，该载体内含有绿色荧光蛋白的基因。对空载pCAMBIA1303的T-DNA进行添加、修饰边界改造，并最终亚克隆成为双元载体。pCAMBIA1303载体内含硫酸卡那霉素筛选标记基因，即其框架为左臂、筛选标记基因（Kan r）和右臂。

构建双元载体pLPGM202的步骤如下，在pCAMBIA1303的T-DNA位置进行扩增，所用引物为Rsat YR（PI-PspI-TTTGCCTGTTTACACCACAAT）与FsatYR（NotI-GTAAACCTAAGAGAAAAGAG），这对引物上分别携带的PI-PspI和NotI的限制性核酸内切酶的酶切位点。用PI-PspI、NotI对PCR产物进行双酶切，再将酶切产物遗传转化，形成克隆载体，在大肠杆菌DH 5α内进行扩增。pSAT6-GFP-N1与pCAMBIA1303的T-DNA用PspI和NotI进行双酶切，通过胶回收获得酶切产物。利用T4连接酶再将双酶切产物与瞬时表达载体进行连接。最终测序检测，结果证实pLPGM202构建成功。

   双元表达载体pLPGM113是由含绿色荧光蛋白基因的pEZS-NL-GFP载体通过pCAMBIA1303的T-DNA边界（2888-9172）进行酶切再连接而成，构建载体pLPGM113的步骤与pLPGM202的构建步骤十分相似。步骤如下：所用的引物设计与pLPGM202不同，创建pLPGM113的引物为Rnl-YR（SpeI-TGTTTACACCACAATATATCC）与Fnl-YR （PstI-GTAAACCTAAGAGAAAAGAG），设计的这对引物分别携带SpeI与PstI限制性核酸内切酶的酶切位点。用T4 DNA连接酶将PCR产物pSIMPLE-19 EcoRV/BAP进行连接，形成克隆载体，并进行遗传转化使之在大肠杆菌DH 5α内进行扩增。pEZS-NL-GFP[27]用SpeI和PstI进行双酶切，通过胶回收获得酶切产物。由pSIMPLE-19 EcoRV/BAP通过SpeI和PstI进行完全酶切得到酶切产物pCAMBIA1303的T-DNA边界区。再将两个双酶切产物用T4连接酶进行连接。最终测序检测，结果证实pLPGM113构建成功。其中，双元表达载体pCM1205-RFP所携带的RFP基因[28,29]是由祁文采博士和张亮博士（河南师大生科院）提供的。

双元载体pLPGM413是由RcSERK1[30]基因和pCAMBIA1303的T-DNA边界修饰加工改造而成，其中RcSERK1基因（Genbank NO.：HM802242）是由Rosa canina（狗蔷薇，蔷薇科植物）的类原球茎（Protocorm-like bodies，PLBs）中克隆得到。通过PCR扩增，PCR引物为：RcSERK1（R-SKs, 5’-TCCCCCGGGCCTTGGACCAGATAAC-3’；F-SKs, 5’-CCCAAGCCTCATGGATAGCAGGCTT-3’）。PCR产物用SmaI和HindIII进行双酶切，连接到SmaI/HindIII间的pLPGM202与CaMV启动子位点上的GFP。最终进行测序检测，检测结果证明双元载体pLPGM413构建成功。

1.3.2 质粒渗入

分别提取含pCM1205-RFP、pLPGM413、pLPGM202和pLPGM113融合质粒，然后进行瞬态转化。将携带pCM1205-RFP的大肠杆菌在LB培养基（25 mg/L氯霉素）中进行摇菌，携带pLPGM413，pLPGM202和pLPGM113的大肠杆菌在LB培养基（100 mg/L硫酸卡纳霉素）中进行摇菌。37℃摇菌过夜，用小量快速提取质粒试剂盒提取质粒，电泳检测。然后用渗透介质进行稀释。抽提转化，转化后置于孵育培养基上，28℃暗孵育。