摘要：本课题通过基因工程手段，将带有壳聚糖酶基因的重组质粒pET28a-inaQN-Csn导入大肠杆菌BL21中，并对重组菌的IPTG诱导表达条件进行优化，获得初步的优化条件。采用单因素实验法分别对诱导时间，IPTG诱导浓度，诱导温度等诱导条件进行优化。结果显示，使产酶量达到最高值时各因素的数值分别为：诱导时间20h，IPTG诱导浓度0.4mmol/L和诱导温度37℃。通过正交实验进一步对影响壳聚糖酶产量的三个因素进行评价，再利用极差分析，最终得到了本课题的最佳诱导因素组合：诱导时间20h，IPTG诱导浓度0.4mmol/L，培养温度37℃，且以时间的影响最为主要。最终，重组菌在最佳诱导条件下，重组壳聚糖酶浓度可达到13338.39mg/L。本研究可为壳聚糖酶在实验室或者大规模生产应用及其进一步开发利用奠定基础。

关键词： 大肠杆菌；壳聚糖酶；诱导表达；条件优化；IPTG

Optimization of IPTG-induced Chitosanase Expression in recombinant Escherichia coli

Abstract: In this study, the recombinant plasmid pET28a-inaQN-Csn with chitosanase gene inserted was introduced into Escherichia coli BL21 through genetic engineering methods. The IPTG inducing conditions for the expression of recombinant E. coli strains were optimized. Single factor experiments were used to optimize induction conditions such as induction time, IPTG induction concentration, and induction temperature. The results showed that the factors when the amount of enzyme production reached the highest value were: induction time 20 h, IPTG induction concentration 0.4 mmol/L and induction temperature 37°C. The three factors affecting the production of chitosanase were further evaluated by orthogonal experiments. Using range analysis, the range of the best inducing factors were finally obtained as follows : inducing 20 h at 37 °C with an IPTG concentration of 0.4 mmol/L. The main effect of the induction condition was time. Finally, the recombinant chitosanase concentration reached 13338.39 mg/L under the optimal conditions. This study can establish foundation for chitosanase study in laboratory or large-scale production application and further development and utilization.

Key words: Escherichia coli; chitosanase; induced expression; condition optimization; IPTG

目录

1 绪论1

1.1 国内外研究现状概述 1

1.1.1 壳聚糖的概述 1

1.1.2 壳聚糖酶的发现和微生物来源1

1.1.3 壳聚糖酶的理化性质及作用1

1.1.4 壳聚糖酶分子水平的研究2

1.1.5 壳聚糖酶菌种的选育 2

1.2 研究内容、目的及意义3

2 材料与方法4

2.1 实验材料4

2.1.1 菌种及培养基4

2.1.2 实验材料与试剂4

2.1.3 仪器与设备5

2.2 实验方法5

2.2.1 重组质粒的转化5

2.2.2 壳聚糖酶蛋白的表达7

2.2.3 条件优化7

2.2.4 SDS-PAGE凝胶电泳9

3 结果与讨论11

3.1重组质粒的验证11

3.2 单因素实验诱导蛋白的凝胶电泳结果11

3.2.1 以时间为单一变量进行壳聚糖酶的诱导表达12

3.2.2 以诱导剂IPTG浓度为单一变量进行壳聚糖酶的诱导表达14

3.2.3 以温度为单一变量进行壳聚糖酶的诱导表达16

3.3 正交试验诱导蛋白的凝胶电泳结果18

3.3.1正交实验凝胶电泳结果和数据分析结果18

3.3.2正交实验方差分析结果24

3.4 讨论25

3.4.1 实验结果的讨论25

3.4.2 实验过程的问题与讨论 26

4 结论27

5致 谢28

6参考文献29

1 绪论

1.1 国内外研究现状概述

1.1.1 壳聚糖的概述

1.1.2 壳聚糖酶的发现和来源

1.1.3 微生物来源壳聚糖酶的理化性质及作用

1.1.4 壳聚糖酶分子水平的研究

1.1.5 壳聚糖酶菌种的选育

1.2 研究内容、目的及意义

壳聚糖在农业、工业中有着巨大的应用潜力，但因水溶性差及分子质量大的性质制约了它更广泛的应用。使用酶降解法将壳聚糖酶有效降解过程反应条件温和、人为易控制、对环境生态无压力，是现在的研究热点之一。主要存在于真菌和细菌细胞中的壳聚糖酶能专一地水解壳聚糖结构中的β-1，4-糖苷键，将其有效降解为壳寡糖等有益于人类生产生活的产物，成为了研究者们降解壳聚糖的首选酶。但普遍的野生型产酶菌株产酶能力较弱，对其进行筛选工作量大且繁琐，使得工厂化生产遇到瓶颈，无法满足大规模工业化的需求。因此，现利用大肠杆菌表达系统的诸多优势，通过基因工程的手段克隆壳聚糖酶基因并进行重组表达，可以解决上述瓶颈问题，有效满足研究和生产的需要。