本课题通过基因工程手段，将带有壳聚糖酶基因的质粒（pET28a-inaQN-Csn）导入大肠杆菌BL21中，诱导其表达并初步优化诱导重组菌表达壳聚糖酶的条件，为壳聚糖酶在实验室或者大规模生产应用及其进一步开发利用奠定基础。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种及培养基

（1） 菌株及质粒：大肠杆菌BL21，从实验室的菌种保藏室中获得；带有壳聚糖酶基因重组质粒（pET28a-inaQN-Csn）：实验室保存

（2） LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl 1%，PH 7.0

2.1.2 实验材料与试剂

（1） 本实验主要试剂以及厂家情况汇总见表2.1

表2.1 实验试剂及厂家情况汇总

实验试剂 厂家

胰蛋白胨、酵母提取物

NaCl固体 OXOID有限公司

江苏强盛功能化学股份有限公司

Kanamycin sulfate 生工Sangon Biotech公司

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG） YEASEN翊圣生物公司

过硫酸铵 国药集团化学试剂有限公司

TEMEDHCl                           Ourchem沃凯公司

国药集团化学试剂有限公司甘氨酸SDS加样缓冲液

乙醇冰醋酸考马斯亮蓝R250                         上海泰坦科技有限公司

上海泰坦科技有限公司

上海润捷化学试剂有限公司

上海润捷化学试剂有限公司

国药集团化学试剂有限公司

（2） 实验相关试剂的配制

1）30%丙烯酰胺：70mL dd H2O中加入29.0g 丙烯酰胺和1.0g N-N-亚甲叉双丙烯酰胺，溶解后定容至100mL，滤纸过滤后置于棕色瓶中，4℃保存。                        

2）10%过硫酸铵：0.5g过硫酸铵溶于5mL ddH2O中，4℃保存，最好现配现用。

3）1.5mol/L Tris-Cl（PH8.8）：36.33g Tris Base溶于ddH2O中，用浓盐酸PH值8.8定容至200mL。

4）1.0mol/L Tris-HCL(PH6.8)：24.22g Tris Base溶于ddH2O中，用浓盐酸调PH值至6.8，定容至200mL。

5）5Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris Base15.1g，甘氨酸94.0g，10%SDS 50-HCL，于dd H2O溶解，定容至1000mL.

6）2SDS加样缓冲液：100mmol/L Tris-HCL（PH8.0），200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT，用前临时添加为宜），4%SDS，0,2%溴酚兰，20%甘油。

5SDS加样缓冲液：100mmol/L Tris--HCL（PH8.0），1.0mol/L 二硫苏糖醇（DTT，用前临时添加为宜），10%SDS，0.5%溴酚兰，50%甘油。

7）染色液：考马斯亮蓝R250，1.0g；甲醇，180mL；水，180mL；冰乙酸，40mL，用滤纸过滤后即可。

8）脱色液：乙醇，50mL；水，850 mL；冰乙酸，50mL。

2.1.3 仪器与设备

本实验所需主要仪器与设备及厂家信息汇总见表2.2。

表2.2 主要仪器和设备及厂家信息表汇总

仪器和设备 厂家

微量移液器DHG-9245A型电热鼓风干燥箱

冰箱 GILSON公司

上海恒科仪器有限公司

海信电器Phs-3D型pH计 上海三倍仪器厂

HWS12生化培养箱

电子天平制冰机压力蒸汽灭菌锅

DYY-8C型电泳仪

HR/T16MM微量高速冷冻离心机

Tan Gis 1000凝胶电泳成像系统 太仓市实验设备

梅特勒-托利多仪器有限公司BILON

上海博讯实业有限公司医疗设备厂

北京六一生物科技有限公司

湖南赫西仪器装备有限公司

上海天能科技有限公司

2.2 实验方法

2.2.1 重组质粒的转化

（1） 感受态细胞的制备

1）从大肠杆菌BL21的平板上挑取一个单菌落，接种于2mL LB液体培养基；

2）37℃，200rpm摇床培养8-10h，置于4℃冰箱过夜；

3）次日以1:100的比例加入100mL LB培养基中，37℃，摇床震荡培养2.5-3h；

4）培养至OD600=0.6左右，冰浴10-30min；