摘  要：集胞藻6803是研究光合作用的模式生物。蓝藻细胞利用CO2浓缩机制(CO2-concentrating mechanism , CCM),对CO2具有高亲和力，而高等植物的光合作用对CO2的固定效率却很低。因此可将蓝藻CCM 途径相关基因sll0822通过Gateway技术构建植物表达载体导入高等植物中。传统构建载体的方法转化效率低，而Gateway技术方法简单、快速、高效。实验结果表明这种方法是行的。

关键字：集胞藻6803；CCM途径；构建载体；Gateway技术

Cloning of Synechocystissp PCC6803 sll0822 Gene and Plant Transformation Vector

Abstract:Synechocystissp PCC6803 is a model organisms for the study of photosynthesis .Cyanobacteria cells using CO2 concentration mechanism (mechanism CO2-concentrating, CCM), CO2 with high affinity, and the photosynthesis of higher plants on the CO2 fixation efficiency is very low. Thus, the CCM patyway related genes sll0822 was introduced into higher plants. Low efficiency of traditional construction method,but the Gateway techonology in this experiment is simple,rapid and efficient.The result showed that this method is feasible.

Keywords: Synechocystissp PCC6803 ;  CCM pathway;  Construction carrier ;Gateway technology

目    录

摘  要 4

引言 4

1.实验材料与方法 5

1.1实验材料 5

1.1.1菌株 5

1.1.2质粒载体 6

1.1.3酶 6

1.1.4抗生素 6

1.1.5试剂 6

1.1.6培养基和缓冲液配方 6

1.2实验仪器 7

1.3实验方法 7

1.3.1PCR反应 7

1.3.2 PCR产物纯化 8

1.3.3琼脂糖凝胶电泳 8

1.3.4Gateway技术 9

1.3.5大肠杆菌转化 9

1.3.6摇菌 10

1.3.7保菌 10

1.3.8质粒提取 10

1.3.9农杆菌转化 11

2.结果与分析 11

2.1 sll0822基因序列 11

2.2sll0822基因的克隆 12

2.3 sll0822基因入门载体的构建 13

2.4 sll0822 基因表达载体的构建 13

3.讨论 14

参考文献 16

致谢 18

集胞藻6803 sll0822基因的克隆及植物转化载体的构建

引言：集胞藻（Synechocystissp.PCC6803）和高等植物一样能进行光合作用，是光合作用分子生物学研究的重要模式生物之一[1]。

蓝细菌利用CO2 浓缩机制(CO2 concentrating mechanism, CCM) 来提高细胞内的 CO2 浓度。CCM 是蓝藻对低 CO2 浓度环境的一种适应。藻类有很强富集CO2 的能力, 其细胞内的CO2 浓度可以达到外界环境的几百倍甚至1000以上[2] 。CCM生物的一个主要生理特征是:植物细胞对 CO2有很强的亲和力,但是这些生物体内催化CO2 固定的限速酶, Rubisco(1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶氧合酶), 与CO2 的结合能力很低, 因此需要高浓度的 CO2才能维持正常的光合作用反应速度[3]。集胞藻(Cyanobacteria)，因基因组小、容易培养、繁殖速度快及能进行光合自养, 而成为研究 CCM 途径的模式蓝藻。

而高等植物和蓝藻所不同的是其细胞内的CO2 浓度低，光合作用效率也低，产生的有机物少。由于蓝藻可以富集CO2，那么光合作用的碳反应底物浓度就提高了，光合作用效率就提高了，产生的有机物就多。为提高农作物的产量，就要提高光合作用的效率，于是我们就想办法将CCM相关基因导入高等植物中，如果能发挥作用，提高CO2 浓度，那么就有可能提高光合作用效率，因此可将CCM相关基因通过构建植物转化载体的方法导入到高等植物细胞中，观察是否可以提高光合作用效率。

由Invitrogen公司开发的通用型克隆方法Gateway技术，在λ 噬菌体位点特异重组系统的基础上，利用位点特异性重组构建入门载体［4 － 6］。在Gateway技术中没有限制性核酸内切酶和DNA连接酶的参与，这种构建载体的方法，具有灵活、快速、成功率高等优点[7]。采用Gateway方法的载体改造现在已经广泛应用在众多领域中，如改造Gateway技术中的载体，可使高通量表达发生于真菌中等。但利用Gateway技术改构建的载体，在植物中进行高通量表达的研究较少或没有研究。本实验基于植物目标载体35ss-GW-3HA和Gateway入门载体pDONER207，构建具有35ss启动子和重组功能区域的植物表达载体35ss-sll0822-3HA，为下一步转基因及功能分析奠定功能。