摘  要：MAPK信号通路是一种从酵母到人类都保守的三级激酶模式，包括MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase，MKK）和MAPK，这三种激酶按照MAPKKK-MAPKK-MAPK的顺序依次激活，在调节细胞的生长、发育、分化、以及对环境适应等多种重要的细胞生理过程方面发挥着重要作用。这次实验主要针对番茄SlMPKK4基因序列进行研究分析，首先用PCR技术克隆SlMPKK4基因，再利用Gateway技术进行载体构建， BP反应于pDONR207中获得入门载体，然后通过LR反应获取终载体。利用PCR对获得的终载体进行检测，成功后再导入大肠杆菌，以运用于后续实验的进行。

关键词：番茄SlMPKK4基因；信号通路；Gateway技术；植物转化载体

Gene Cloning and Plant Transformation Vector Construction of  SlMPKK4

Abstract: MAPK signal pathway is a conservative level 3 kinase from yeast to humans all patterns,including the MAPK kinase kinase (MAP kinase kinase kinase, MKKK), MAPK kinase (MAP kinase kinase, MKK) and MAPK, these three kinases in accordance with the sequence MAPKKK - MAPKK - MAPK activation, in regulating cell growth, development, differentiation, and adapt to the environment, and other important physiological processes of cells play an important role. The experiment mainly aimed at the tomato SlMPKK4 conduct gene sequence analysis, first of all use PCR technology to obtain plenty of SlMPKK4 gene, reuse of Gateway technology carrier construction, BP's response to gain entry pDONR207 carrier, and then through the LR reaction to obtain final carrier. PCR was used to obtain final carrier for testing, after successful import, E. coli to use was conducted in the subsequent experiment.

Key words: Tomato SlMPKK4 genes; Signal pathway; Gateway technology; Plant transformation vector

目    录

摘  要： - 1 -

关键词： - 1 -

引言 - 1 -

1.材料与方法 - 2 -

1.1实验仪器 - 2 -

1.2实验材料 - 3 -

1.3实验试剂 - 3 -

1.4酶 - 3 -

1.5抗生素 - 3 -

1.6实验方法 - 4 -

1.6.1 PCR扩增 - 4 -

1.6.2琼脂糖凝胶电泳检测 - 4 -

1.6.3产物纯化 - 5 -

1.6.4Gateway technology - 5 -

1.6.5 农杆菌转化 - 6 -

2.结果与分析 - 7 -

2.1 PCR电泳图 - 7 -

2.2 BP反应构建入门载体 - 8 -

2.3 LR反应构建终载体 - 9 -

2.4农杆菌转化菌液电泳 - 9 -

3.讨论 - 10 -

参考文献 - 12 -

致谢 - 14 -

番茄基因SlMPKK4的克隆分析及植物转化载体的构建

引言

蛋白激酶(MAPK)级联功能关键信号传感器,使用蛋白质磷酸化/脱磷酸作用周期通道信息，MAPK级联在所有真核生物通常相通顺序激活，激活MAPK激酶激酶(MAP3Ks)第一次使磷酸化两对丝氨酸或苏氨酸残基位于MAPK激酶的活化循环(MAP2Ks) [3]。MAP3K激活,这可能是直接或间接地影响模式识别接收器,反过来导致下游MAP激酶激酶的磷酸化和激活(MAP2K;也叫MKK或MEK)，随后, MAP2K磷酸化下游顺序导致其亚细胞定位的变化和/或下游的磷酸化底物包括转录因子的基因表达模式的改变由于不同的细胞外刺激或介导细胞表面至细胞核的信号转导而被激活，结合其它信号途径，它们能够改变转录因子的磷酸化状态[8]。MAPK信号通路有不同的调控方式，如转录水平，磷酸化状态等，不同条件下会启动不同的调控方式[13]。促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK),属于丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶,是一组在进化上高度保守的蛋白激酶,是真核生物信号传递网络中的重要组分,在真核生物细胞外信号向细胞内传输及放大的过程中发挥着重要作用[14]。MPK3、MPK4、 MPK6都激活pamp flg22(一种守恒的22个氨基酸鞭毛蛋白肽)和elf18(伸长factor-Tu肽)，然而,这三个MAPK级联是不同的模式识别接收器[15]。根据信号调控的基本特性，我们对番茄的SlMPKK4基因进行研究，以期获得对整个信号通路的整体把握，对基因进行改造，来获得对我们有益的目的基因[17]。在该过程中我们使用PCR技术进行基因扩增，利用Gateway 技术进行载体构建，通过BP反应得到入门载体，然后利用LR反应获取终载体。终载体在检验成功后导入大肠杆菌，进而转化到农杆菌，利用农杆菌侵染烟草等。通过对试验后烟草的观察和检测对我们的实验进行评价，为接下来的实验提供一定的依据。