2材料与方法

2.1物种抽样与数据来源

   本研究涉及到鱼类物种有8个，分别为青鳉、红鳍东方鲀、斑马鱼、雀鳝、金娃娃、矛尾鱼、剑尾鱼和三刺鱼。本文以这些鱼类线粒体基因组作为研究对象，从这些基因组中分离出5个编码基因的蛋白用于选择压力检测。线粒体基因组序列下载于CoGe数据库，接下来从线粒体基因组中截取ATP6、CYTB、ND5、ND1和CO3基因的编码序列，同时在Ensembl数据库中下载相应的蛋白序列。

2.2 序列比对与系统发生树构建

以矛尾鱼、雀鳝和青鳉等8种鱼类物种线粒体基因组中的5个线粒体编码基因为对象，在下载这5个线粒体基因(NADH 5，CYTB，COX3和 ATP6)蛋白序列基础上，利用在线工具MUSCLE(http://www.phylogeny.fr/)对所有蛋白序列进行比对；将比对结果以Clustal格式保存在文本文件中，然后直接提交到该网站的BioNJ工具进行建树[10]；接下来，将树文件直接提交到DrawTree在线服务器上，绘制系统发生树。

2.3 树文件和序列文件准备

为进行选择压力检测，必须准备两个文件，即序列文件和树文件。为准备序列文件，首先我们对每一个线粒体基因的蛋白进行序列比对，该过程由在线工具MUSCLE(http://www.phylogeny.fr/)完成。然后，利用在线工具Pal2nal把比对的蛋白序列转化为密码子比对，具体步骤参见Pal2nal工具的说明书，将准备好的密码子比对文件保存成文本文件，同时一定要以PAML格式保存[11]。此外，树文件由获得密码子比对文件产生，该过程由在线工具MUSCLE和BioNJ(http://www.phylogeny.fr/)协作完成。

2.4 基于位点模型检测选择压力

    为阐明鱼类线粒体基因NADH5，CYTB，COX3和 ATP6受到选择压力类型，笔者利用位点模型对这些基因进行了选择压力分析。具体过程如下：准备好树文件、密码子比对文件、Codeml执行文件和Codeml控制文件，利用命令行或鼠标运行Codeml执行文件[12-13]。继Codeml程序运行完之后，我们从mlc结果文件中获得这些基因的选择压力结果，整理这些结果推测鱼类线粒体基因的正选择位点。

3结果与分析

3.1鱼类线粒体相关基因的鉴定

为挖掘鱼类线粒体基因组内包含的基因，本研究直接从NCBI数据库中下载青鳉、红鳍东方鲀、斑马鱼、雀鳝、金娃娃、矛尾鱼、剑尾鱼和三刺鱼线粒体基因组序列，它们分别是NC_004387，NC_004387、NC_004299、NC_002333、GCF_000242695、NC_007176、NC_001804、NC_011379，这些线粒体基因组长度分别为16714 bp、16447 bp、14479bp、13581bp、16462 bp、16407 bp 、16646 bp 、15742 bp，最长是16646 bp ，最短是14479bp，线粒体基因组长度位于14479bp-16646 bp范围之内。接下来，利用已有的线粒体注释信息和ORF框预测工具分别对这些线粒体基因组中的基因进行了预测，结果显示，多数鱼类含有13个编码蛋白。本研究从这些蛋白中选取了ND1、ND5、ATP6、COX3和CYTB蛋白作为进一步研究的编码蛋白，用于选择压力检测分析。为确证ND1、ND5、ATP6、COX3和CYTB蛋白的正确性，利用NCBI数据库中的CDD工具扫面这些蛋白的保守功能区，结果表明：ND1、ND5、ATP6、COX3和CYTB蛋白分别包含典型的NADHdh、NADH5_C、ATP6、Cyt_c_Oxidase_III和Cytochrome_b_N结构域。

3.2系统进化关系

为阐明鱼类线粒体基因组之间的进化关系，选取了8个物种作为研究对象，每个物种从线粒体的13个蛋白编码基因中均选取了五种相同的线粒体基因，即ND5，CYTB，COX3，ATP6和ND1，其中ATP6在鱼类线粒体基因组中的进化速度较早于其他四个基因，而COX3和ND1这两个基因在进化过程具有相同的祖先基因，然而同一个物种的这两个基因在进化过程中发生了较大的差异，不是旁系同源基因。通过观察进化树可以分析出矛尾鱼和青鳉的ND5，CYTB，COX3和ATP6基因起源相同，说明进化过程中产生的差异较小，亲缘关系较大，青鳉的ND1基因则和剑尾鱼基因有着相同的祖先基因，而矛尾鱼的ND1在进化过程中较早于青鳉基因的出现，说明在进化过程中这两个物种的这种基因分化程度差异较大。从进化树中可以看出雀鳝和剑尾鱼的ND5基因具有相同的起源，这两种鱼类的其他四个基因则在进化过程中出现较大的差异，不是旁系同源基因，但是雀鳝和金娃娃的ND1，ATP6基因却起源相同，执行的功能也相同。红鳍东方鲀只有ND1和三刺鱼有同源基因，其他四种基因和另外七个物种在进化过程发生了分化，执行的功能相差较大。斑马鱼的5个基因在进化过程中均较早发生了分化，不存在旁系同源基因。