摘要： 本实验是对单克隆抗体纯化工艺的探究以及对其纯化工艺的优化，得出最佳纯化条件应用于对单克隆抗体的纯化。此次实验主要通过阴离子层析方法和阳离子层析方法来去除单克隆抗体携带的杂质，其中对阴离子层析-填料筛选，载量，上样pH等几个方面进行研究，和阳离子层析-填料筛选、动态载量、洗脱条件等方面进行研究，实验以抗体蛋白回收率，SEC,CEX,CE-SDS等为指标。结果表明通过阴离子和阳离子层析，能够使单克隆抗体纯度高与目标研制药相近，达到纯化的目的。

关键词:  单克隆抗体；蛋白抗体纯；阴离子流穿层析；阳离子结合层析;回收率

Monoclonal antibody purification process optimization

Abstract:  This experiment is to explore the process of purification of monoclonal antibodies and the optimization of its purification process, to obtain the best purification conditions for the purification of monoclonal antibodies. In this experiment, the impurities carried by monoclonal antibodies were mainly removed by anion chromatography and cation chromatography. In the anion chromatography, filler screening, loading, and loading pH were studied, and in the cation chromatography, filler screening, dynamic loading, elution conditions, and other factors were studied. The experimental antibody protein recovery, SEC, CEX, CE-SDS were selected as responses. The results showed that the purity of the monoclonal antibody can be similar to that of the targeted drug by the anion and cation chromatography, achieving the purpose of purification.

KeyWords: Monoclonal antibody; Protein antibody pure; Anion flow-through chromatography; Cation binding chromatography; Recovery

目  录

1. 绪论 1

1.1 单克隆抗体的研究概况 1

1.1.1 单克隆抗体药物简介 1

1.1.2 单克隆抗体的构建解析 2

1.2单克隆抗体纯化研究概况 2

1.2.1 单克隆抗体纯化简介 2

1.2.2 单克隆抗体纯化流程 2

1.3 离子层析的研究概况 3

1.3.1 离子层析柱的原理 3

1.3.2 阴阳离子层析流程 4

1.4 离子层析的优势 4

2.材料与方法 5

2.1 实验材料及仪器 5

2.1.1实验仪器 5

2.1.2实验缓冲液 5

2.2 实验设计 6

2.2.1 蛋白纯化仪器 6

2.2.2 分辨率 7

2.2.3 盐浓度洗脱 7

2.2.4  pH洗脱 7

2.3 实验流程 7

2.3.1 阴离子填料筛选 7

2.3.2 阴离子开发DOE 8

2.3.3 阳离子填料筛选 9

2.3.4 阳离子开发DOE 10

2.3.5 参数计算公式 10

3.结果与分析 11

3.1 阴离子流穿层析 11

3.1.1填料筛选 11

3.1.2载量与上样pH DOE 12

3.2 阳离子结合层析 15

3.2.1 填料筛选 15

3.2.2 载量、保留时间和盐浓度DOE 16

3.3蛋白纯度分析 22

4.结论与展望 24

4.1 结论 24

4.2 展望 24

致谢 25

参考文献 26

1. 绪论

1.1 单克隆抗体研究概况

1.1.1 单克隆抗体药物简介

在1975年，Kohler 和Milstein两位著名生物学家发明了单抗技术,在当时轰动了整个生物界，更是获得了诺贝尔奖。单克隆抗体(monoclonal antibody，简称单抗)由骨髓瘤细胞和B淋巴细胞杂交得到杂交瘤细胞中产生的，其轻链和重链所组成的结构域可以通过识别特异性抗原并与之结合，经过了20年的发展，如今的全人源性抗体，在逐步解决了（1）消除单克隆抗体的免疫源性，（2）提高了对抗原高亲和力，（3）改善了抗体的药动力学等问题。2001 年5月，《时代周刊》封面文章指出疗性单克隆抗体是在于癌症战斗过程中人类的一次重大胜利[1]。

单克隆抗体药物的治疗机制主要是由：1. 诱导癌细胞凋亡或抑制癌细胞生长和代谢。2.通过补体效应或ADCC 间接杀死癌细胞。3. 用单克隆抗体荷载同位素、毒素蛋白、抗生素等药物制成生物导弹来对癌症、心血管等疾病进行导向治疗。4. 用单抗制成预防药物可以避孕、抵御传染病等等[2]。现代重组表达技术的广泛更是使用是我们能够无限的对免疫球蛋白，免疫球蛋白片段，蛋白表达标签或特异性蛋白进行重组，使得单抗更容易操控，与生产[3]。在2000 年人类基因组序列初稿的完成，使得近年结构基因组技术与蛋白质组的发展十分迅速，也给单克隆抗体研究带来更多机遇和挑战。现在中国也大力推动的抗体药物组、学抗体组学和抗原表位组学等等，将会对中国的单抗技术的发展打来很大的促进作用。全人源化抗体如今已经被广泛应用，单抗药物更是占据生物药品市场的20％，所以研究对于单抗中去除宿主细胞的去除和DNA残留的纯化工艺具有非常重要社会的意义。