1  材料与方法

1.1  实验材料与仪器

蚂蟥由南京农业大学中药研究所提供，经过郭巧生教授鉴定为蚂蟥(Whitmania pigra Whitman)；螺蛳（采自南京前湖，野生）经过郭巧生教授鉴定为梨形环棱螺（Bellamya purificata Heude）。

电子天平（上海精密仪器厂）、FA 1104分析天平(上海精密科学仪器有限公司)、pH计（青岛昱昌科技有限公司）、Alpha-1506紫外可见分光光度计(上海谱光仪器有限公司)、HH-S型水浴锅(巩义市予华仪器有限责任公司)、5810R离心机、XHF-D匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司）、MR210A溶氧测量仪（南京特安科贸科技有限公司）、FYL-YS-108L低温保存箱（北京福意电器有限公司）、KQ250B超声仪（苏州昆山市超声仪器有限公司）、光照培养箱。

1.2  方法

1.2.1  蚂蟥冬眠模式的制备  

实验用的蚂蟥统一暂时养于透明的玻璃缸中，养殖时间为7d，期间养殖温度为25℃，溶氧量保持在5.5-7.5mg·L-1，以天然饵料螺蛳为食物常规饲养。实验前停止喂食12h，随机选取10g左右体格健壮的蚂蟥，置于480ml注水2/3体积的广口玻璃瓶中。实验初始温度为25℃，以1℃/d的速度降温至4℃[6-7]后保持稳定，处理40d记为冬眠组。

1.2.2出冬眠模式的设计

直接回温不投喂组  随机选取4组（每组3条）冬眠40d蚂蟥直接转移到25℃水温的玻璃瓶中（在光照培养箱中进行控温），分别培养12h、24h、48h和72h后取样进行消化酶的测定，观察蚂蟥出眠状态，期间不投喂螺蛳；

直接回温投喂组  随机选取4组（每组3条）冬眠40d蚂蟥直接转移到25℃水温的玻璃瓶中（在光照培养箱中进行控温），分别培养12h、24h、48h和72h后取样进行消化酶的测定，观察蚂蟥出眠状态，期间均在取样前12h投喂螺蛳，每条蚂蟥平均投喂1颗；

梯度回温不投喂组  随机选取5组（每组3条）冬眠40d蚂蟥以先前降温模式进行梯度回温，温度升高至5℃、10℃、15℃、20℃、25℃时，分别稳定12h后取样进行消化酶的测定，观察蚂蟥出眠状态，期间不投喂螺蛳；

梯度回温投喂组  随机选取5组（每组3条）冬眠40d蚂蟥以先前降温模式进行梯度回温，温度升高至5℃、10℃、15℃、20℃、25℃时，分别稳定12h后取样进行消化酶的测定，观察蚂蟥出眠状态，期间当到达实验设定温度时投喂螺蛳，每条蚂蟥平均投喂1颗。

将不同处理阶段的成龄蚂蟥取出，取其消化道细胞，进行实验测定。

1.2.3  样品酶液的制备

每组选取3条健壮蚂蟥放在浓度为50%的乙醇溶液中浸泡10min进行麻醉，取出麻醉后的蚂蟥固定在冰盘上，用解剖刀进行解剖，取出整个消化道，剔除消化道附着物，用预冷的蒸馏水冲洗干净，用吸水纸吸干组织表面的水分，放在离心管中称重，在冰浴中进行匀浆，同时滴加预冷的蒸馏水，将原浆稀释成含量为20%的稀溶液，4℃下离心15min（转速为8000r•min-1），所得上清液即为实验所需的酶液。将分离出的酶液放置于4℃冰箱中低温保存，并于24h内测定完成。

1.2.4  样品的淀粉酶活性测定  

采用3，5-二硝基水杨酸比色法[8]进行测定。在37℃的条件下，单位体积的酶量，每分钟水解淀粉生成1mg还原糖的产量为1个淀粉酶活力单位。

1.2.5  样品的脂肪酶活性测定

采用对-棕榈酸硝基苯酯(p-NPP)比色法[9]进行测定。在37℃的条件下，pH为8.2情况下，每分钟催化释放1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1个脂肪酶活力单位。

1.2.6  样品的蛋白酶活性测定  

采用福林-酚法[8]进行测定。在37℃和已定的pH条件下，每分钟水解干酪素产生1μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活力单位。酶液蛋白含量采用考马斯亮蓝比色法测定[10]。