电化学方法具有灵敏度高、简便快捷、无标记检测等优点[15,16]，已被证明可运用于蛋白质蛋白糖基化和磷酸化等后修饰过程的检测。电化学交流阻抗谱法（EIS）是电化学研究中的一种重要表征技术。电化学阻抗谱是一种以小振幅的正弦波电位作为扰动信号的电化学测量方法，同时又是一种频率域的测量方法。由于电信号对检测体系进行小振幅扰动，可避免对体系产生较大的改变，也可以使得扰动与体系的回应之间发生近似成线性的关系，从而可以轻松地对测量得到的曲线数据进行分析处理。此外，该技术根据测量得到的阻抗谱来研究传感器系统，且阻抗谱的频率范围比较宽，因此能得到更多的动力学信息及电极界面修饰过程的信号。方波伏安法（SWV）是一种多功能的线性循环扫描电压的高效能电分析方法。扫描结果包括两部分，表示电压上升的前半部分以及表示电压下降的后半部分。前半部分表示金电极表面被还原的阴极过程，后半部分表示电极表面物质重新被氧化的阳极过程[36]。

   DNA在电极表面的修饰已被广泛应用于很多领域[17-21]，据报道，一种单链DNA（c-kit-1）可高效结合PARP并激活它，此结合使PARP的电化学定量分析成为可能。更为重要的是，由于PARP的自然催化产物带负电荷，可以采用带正电荷的电化学信号分子实现PARP的无标记电化学定量分析[22]。所以，电化学技术是检测没有修饰底物或抗体参与的PARP的优先选择[23]。如图2所示，在这项研究中，我们构建了一个可用于无标记检测PARP及其抑制剂的电化学生物传感器。首先，将带有巯基的DNA（c-kit-1） 固定在电极表面，形成一个Au-S共价键。然后，DNA（c-kit-1）在MCH（巯基己醇）的作用下修饰金电极，促使c-kit-1四聚体构型的形成。众所周知，PARP可与c-kit-1 四聚体结构直接结合，形成PARP同源二聚体，随后开始在电极表面进行ADP核糖基化过程[24]。结果，NAD+ 被裂解为烟酰胺和ADP核糖单元，共价结合到PAPR，并通过重复反应形成带负电荷的聚合物[25]。由于静电作用，带正电荷的信号分子六氨合钌（RuHex）能够吸附在电极表面产生强烈快速的电化学反应[26]。因此，PARP的无标记定量检测可在电化学信号特征的基础上实现。值得注意的是，受益于DNA可稳定修饰自组装电极的实现，使电化学生物传感器可用于长期检测[27]。此外，c-kit-1和PARP的结合可被轻易解除，这使得该生物传感器被进一步赋予重复利用的性能，更适用于常规应用[28]。

                                    图1 PARP催化反应

                    Figure 1  Schematic Illustration of Reaction Catalyzed by PARP  

      图2  一种稳定且可重复使用的PARP电化学生物传感器及基于酶触发的PARP抑制剂原理图

     Figure 2  Schematic Illustration of a Stable and Reusable Electrochemical Biosensor for PARP and Its  

                       Inhibitor Based on Enzyme-Initiated Auto-PARylation

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验药品  

实验中涉及的主要实验试剂如表1所示。

                                           表1 实验试剂

Table 1  The reagents used in experiment