试剂名称 生产厂家

          巯基己醇（MCH）

乙二胺四乙酸（EDTA）

六氨合钌(RuHex)

焦碳酸二乙酯（DEPC)

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）

          牛血清血蛋白（BSA）

磷酸三氯乙酯（TCEP）

人PARP（113kD）

          3-AB(APRP抑制剂）

          其他常规试剂 美国Sigma-Aldrich公司

美国Sigma-Aldrich公司

美国Sigma-Aldrich公司

美国Sigma-Aldrich公司

美国Sigma-Aldrich公司

美国Sigma-Aldrich公司

美国Sigma-Aldrich公司

美国 Trevigen公司

阿拉丁（上海）股份有限公司

国产分析纯

1.1.2实验溶液

实验中涉及的主要溶液均由从Milli-Q纯化水系统（Millipore Corp., Bedford, M）中收集的双蒸水配制，如表2所示。

 表2 实验溶液

Table 2  Different buffers used in experiment

缓冲液 配方

固定缓冲液（I-buffer） 10 mM Tris–HCl，1 mM EDTA，10 mM TCEP和0.1 M NaCl，pH 7.4

杂交缓冲液（H-buffer） 10 mM PBS 和0.25 M NaCl，pH 7.4

结合缓冲液（B-buffer） 10 mM PBS，0.1 mM NaCl, 5 mM MgCl2和5 mM KCl, pH 7.4

洗涤缓冲液（W-Buffer） 20 mM Tris–HCl，0.1 M NaCl，5 mM MgCl2和1% Tween-20，pH 7.4

电化学阻抗谱（EIS）缓冲液 5 mM [Fe(CN)6]3-/4- 和 1M KNO3

方波伏安法（SWV）缓冲液 10 mM Tris-HCl 包括5μM RuHex，pH 7.4

1.1.3 实验DNA

   寡核苷酸（c-kit-1）由上海英骏生物技术有限公司合成和纯化，序列如下：

   c-kit-1:5′-SH-CCCGGGCGGGCGCGAGGGAGGG-GAGG-3′.

1.1.4实验仪器

电化学仪器CHI 660E（中国上海）

1.2 方法

1.2.1 金电极表面的预处理

采用经典的预处理方式进行金电极的预处理。具体步骤如下：用1微米、0.3微米三氧化二铁粉末分别对直径为3 mm金圆盘电极进行抛光，之后用酒精和超纯水分别超5分钟。清洗之后将金电极分别置于水虎鱼（浓硫酸∶H2O2 的体积比＝3∶1）和50％的硝酸溶液中浸泡5分钟和30分钟。之后将处理好的电极置于0.5 M H2SO4 中，在0V-1.5 V电压范围内进行循环伏安扫描，扫速参数设置为0.1 V/s，直至达到稳定后，用氮气吹干电极表面。

1.2.2  c-kit-1修饰电极的组装

   将上述1.2.1中经过经典方法预处理的金电极浸泡100 μL含0.2 μM c-kit-1的定溶液（10 mM Tris-HCl，10 mM TCEP，0.1 M NaCl，pH 7.4）室温孵育12小时，再将该电极浸泡于含1mM巯基己醇溶液1小时。用蒸馏水冲洗后，再将电极浸泡于100μL的四聚体形成溶液（50 mM Tris-HCl，100 mM KCl，pH 7.4），放置于95℃ 孵育5分钟后，缓慢冷却至室温（约6小时），促使c-kit-1形成四聚体构型。

1.2.3 样品与修饰电极的孵育和酶催化  

将上述1.2.2中c-kit-1修饰的金电极与100 μL含有不同浓度PARP的反应溶液（50 mM Tris-HCl，50 mM KCl，2 mM MgCl2，50 μM Zn(OAc)2，pH 7.4）25℃ 孵育1小时，再将电极浸泡于100 μL含有500 μM NAD+ 反应溶液中，25℃ 孵育1小时。

1.2.4  PARP的电化学检测

将经过上述1.2.3处理的电极置于5 mL 含5 μM六氨合钌（RuHex）的缓冲溶液（10 mM Tris-HCl，pH 7.4）中，进行电分析定量检测。本检测采用的电化学工作站（CHI 660E），以饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极。使用的扫描方法为方波伏安法，参数设置：初始电位-0.5 V，终止电位-0.2 V，电位增量0.004 V，振幅0.025 V，频率30 Hz。PARP越多，吸附的电信号分子RuHex也就越多，因此，得到的电化学信号也就越大。以RuHex的电化学信号为纵坐标，PARP的浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算PARP的浓度，即可实现PARP的灵敏检测。