C9H23NO3Si 色谱纯 上海成捷化学试剂有限公司

2.2.3 实验仪器

TENSOR 27型红外光谱仪 德国Bruker公司

多功能酶标仪SpectraMax i3 美谷分子仪器有限公司

场发射扫描电子显微镜 日本日立公司

XRD-6000X射线衍射仪 日本岛津公司

XDS-500倒置荧光显微镜 上海蔡康光学仪器有限公司

微量注射泵 保定兰格恒流泵有限公司

控温箱 DT-230C 天津市东康科技有限公司

超净工作台 苏州安泰空气技术有限公司

低温高速离心机 赛默飞世尔科技公司

高压蒸汽灭菌锅 日本SANYO公司

超低温冰箱 美国赛默飞世尔公司

超声波仪TEA-1004 台姆超声

数显pH计 德国赛多利斯有限公司

移液枪 德国Eppendorf

电子天平 上海精密科学仪器有限公司

2.2 重组大肠杆菌的诱导表达

2.2.1 培养基与试剂

（1）LB液体培养基的配制[26]

精密称取胰蛋白胨2 g、酵母膏1 g、NaCl 2 g,加无菌水定容至200 mL溶解,于高压蒸气灭菌锅内121 ℃灭菌1 h。

（2）LB固体培养基的配制[27]

分别精密称取胰蛋白胨2 g、酵母膏1 g、NaCl 2 g、琼脂粉3 g,加无菌水定容至200 mL溶解,于高压蒸气灭菌锅内121 ℃灭菌1 h。

（3）卡那青霉素的配制[28]

将0.5 g的卡加无菌水定容至5 mL溶解，置于4 ℃冰箱冷藏保存。

2.2.2 诱导重组菌株的表达

选取保存的菌种，接种于含有卡那青霉素抗性（50 μg/mL）的LB液体培养基中（3~5 mL），37 °C振荡培养生长至指数期，然后以2 %的接菌量转接到含有卡那青霉素抗性（工作浓度50 μg/mL）的LB液体培养基中（500 mL），22 ℃恒温振荡培养至OD600达到0.6~0.8时，然后添加400 μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），将温度降到17 °C进行低温诱导表达16~20 h。将上述诱导表达结束的菌液在4 ℃下 8000 rpm 离心5 min，收集菌体；用pH 7.2~7.4 PBS缓冲液清洗菌体两次，收集菌体[29]（见图2.1）。

图2.1重组大肠杆菌E. coli BL28- EGFP在紫外灯箱中。

Figure 2.1 Recombinant E. coli BL28-EGFP in an ultraviolet light box.

2.3 重组大肠杆菌生长曲线的测定

2.3.1 重组大肠杆菌的复苏及初培养

将-80 ℃冻存的重组大肠杆菌划线接种于LB固体培养基上,于37 ℃恒温培养箱中培养12-16 h。从平板上挑取单个菌落接种于200 ml含卡那青霉素的LB液体培养基中,于37 ℃、200 r/min的摇床中培养至OD600值为0.6左右[30]。

2.3.2 重组大肠杆菌的转接种

取3支500 mL锥形瓶,每支加入200 ml LB液体培养基，按1︰100的比例将加入菌液培养至OD600值为0.6左右菌液分别接种到3支锥形瓶中,1支不接种，作为阴性对照。将3支锥形瓶于37 ℃、200 r/min的恒温摇床中培养。测 OD600值，每个时间点重复测定3次。

2.3.3 菌液OD600值的测定及生长曲线的测定

分别于培养了0，1.5，3，4，6，8，10，12，14，16，18和20 h的菌液里取出4 mL菌液测定OD600值，每个时间点重复测定3次。以重组大肠杆菌菌液培养时间为横坐标，所测菌液的平均OD600值为纵坐标,绘出重组大肠杆菌的生长曲线[30]。