Kang等[15]在研究碳纳米管的毒性时发现，当E.coli MG1655在10 mg/L CNT下暴露24 h后，CNT有一定程度被E.coli细胞内化。葛钼等[3]人研究了纳米氧化锌对细菌的致毒机理时发现，纳米颗粒与细菌的直接接触可导致其物理损伤，破坏细胞膜的通透性，继而进一步进入细胞。在此基础上，本文研究了不同种纳米粒子对细菌形成生物被膜的胁迫效应。

1.5 本课题的研究意义及主要内容

1.5.1 本课题的研究目的及意义

微流控技术作为影响人类未来最重要的发明之一，具有高速混合、高效传热、停留时间分布窄、重复性好、系统响应迅速、便于自动化控制、几乎无放大效应以及安全性能高等诸多优点[23, 24]。当前，微流传质能够显著影响酶催化的立体选择性和时空效率，这有助于深入认识微尺度下天然产物的生物合成过程，更有助于克服传统合成中的反应器体积大、催化选择性低、过程控制困难、产物成分复杂难分离等问题。因此，微流控技术已成为酶催化天然产物糖基定向改造的重要手段。

生物被膜催化剂在微通道中的应用研究已经成为微型生催化的研究热点。目前，主要探索微通道中生物被膜的多相催化应用[12]。微尺度下通道尺寸更接近与生物体内环境，分段式微流传质更能精准的控制细胞生长环境和过程，这有效地解决了生物被膜生长不可控的问题，为生物被膜成功制备提供新的手段和思路[25]。由此，本项目提出将重组大肠杆菌在分段流微通道反应器内培养制备菌膜，这将有助于拓展微型生物催化的学科理论体系，推动工业生物催化新方法的形成与发展。

1.5.2 主要内容

（1）设计微通道反应器并优化“空气/营养液”分段流调控方法；

设计有微通道反应器的微流控芯片，采用分段流方式，用于制备生物被膜，利用硅烷试剂修饰通道表面，将菌株与生物兼容性纳米粒子混合后通入微通道中固定化，随后将菌株生长所需的氧气和培养液通入微反应器中供菌株生长。

（2）考察重组大肠杆菌的不同生长周期对其成膜特性的影响；

采用多种表征手段对生物被膜的形态结构进行分析 ，包括用荧光倒置显微镜、傅里叶变换衰减全反射红外光谱(FTIR)分析表面结构特征，用场发射扫描电镜（ESEM）观测细微结构等。

（3）研究微通道内重组大肠杆菌菌膜的生长特性及形态结构；

分别测量重组大肠杆菌不同生长时期的菌液的OD值,以时间为横坐标,以OD值为纵坐标建立坐标系,绘制出大肠杆菌生长曲线；测定重组大肠杆菌最适pH值最适生长温度，采用XRD、SEM等表征重组菌株形态结构。

（4）考察纳米粒子对生物被膜的形成过程影响及胁迫效应。

测定不同含量纳米粒子对生物被膜生物量的影响；用傅里叶变换衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)分析纳米粒子对生物被膜表面结构特征的变化。

（5）本文的技术路线图如图1.6所示：

图1.5技术路线图

Figure 1.5 Technical roadmap

第二章 实验材料和方法

2.1 实验药品和仪器

2.1.1 实验材料

重组大肠杆菌E. coli BL28- EGFP，玻璃毛细管，聚四氟乙烯管，注射器

2.2.2 实验试剂

甲醇 分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司

乙醇 分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司

戊二醛 分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司

氯化钠 分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司

结晶紫 分析纯 上海国药集团化学试剂有限公司

琼脂粉 分析纯 OXOID Co., UK

胰蛋白胨 分析纯 OXOID Co., UK

卡那青霉素 分析纯 OXOID Co., UK

磷酸氢二钠 分析纯 镇江器化玻有限公司