摘  要：本研究主要是利用PCR克隆技术对番茄MPK4基因进行扩增，再运用Gateway技术对番茄的MPK4基因进行植物转化载体的构建，虽然目前在植物的研究中发现了大量的MAPK基因，并且对其的作用机制也取得了许多很大的进展，但是目前对于番茄中的MAPK基因的研究还是较少。随着关于番茄基因组的测序的完成，对与番茄MAPK基因族的研究也大大的加快了。MAPK基因族在植物的生长、发育、分化、凋亡及生物抗性与非生物抗性等许多方面都起着非常重要的作用，而番茄作为植物中的模式生物具有着很强的代表性，对番茄的MAPK基因族的表达特性及作用方式的研究有助于我们研究植物中的MAPK基因族的作用，而本研究对番茄的MPK4基因进行克隆分析及植物转化载体的构建对于以后研究番茄MPK4基因的表达特性及作用方式提供了一个良好的基础。

关键字： SlMPK; Gateway技术；番茄；基因克隆

Construction of plant transformation vector and cloning and analysis of tomato SlMPK4 gene

Abstract: This experiment is mainlthe use of PCR gene cloning techniques to amplify tomato MPK4, then the Gateway Technology was used to construct the plant transformation vector of tomato MPK4 gene. Although a large number of MAPK genes have been found in the study of plants, and the mechanism of its action has made a lot of progress, but now the study of tomato MAPK gene fewer. With the completion of the sequencing of the tomato genome，the study of MAPK gene family in tomato has been greatly accelerated. MAPK gene family in many aspects of plant growth, development, differentiation, apoptosis and biological resistance and abiotic resistance and so plays a very important role,the tomato plants as model organisms have a strong representation,the study on the expression and function of MAPK gene family in tomato will help us to study the role of MAPK gene family in plants. This study(Construction of plant transformation vector and cloning and analysis of tomato SlMPK4 gene) provided a good basis for the study of the expression and function of MPK4 gene in tomato.

Keyword: SlMPK; Gateway technology; Tomato; Gene cloning

目   录

摘  要 1

引  言 2

1.材料与方法 3

1.1 实验仪器和试剂 3

1.2试验方法 4

1.2.1目的基因PCR扩增 4

1.2.2琼脂糖凝胶电泳检验 5

1.2.3产物纯化 5

1.2.4提质粒 5

1.2.5 BP反应 6

1.2.6 LR反应 6

1.2.7 大肠杆菌转化 7

1.2.8摇菌 7

2.结果与分析 7

2.1目的基因PCR扩增电泳检测分析 7

2.2 BP菌液PCR电泳检测分析 8

2.3 BP反应构建质粒电泳检测分析 8

2.4 LR菌液PCR电泳检测分析 9

2.5 LR反应构建质粒电泳检测分析 9

3.讨论与结论 10

参考文献 11

致  谢 13

番茄基因SlMPK4的克隆及植物转化载体的构建

引  言

番茄（Solanum lycopersicum L）是茄科番茄属中的草本植物，它原产与南美洲，是全世界栽培最为普遍的果菜之一，中国各地普遍种植，栽培面积仍在继续扩大，是我国夏秋季主要栽培的蔬菜[1]。番茄作为一种世界性蔬菜，在蔬菜生产中占有举足轻重的地位，也是基础生物学研究中的重要对象和模式植物，并且在所有蔬菜作物中番茄的研究文献居于首位。目前，番茄基因组测序也已经完成,且番茄中的MAPK基因家族也已经找到，所以研究在基因组水平上去解析番茄MAPK家族的信息已经成为可能，而所谓的MAPK中文叫做促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）它是一组能被各种不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，由于MAPK是培养细胞在受到生长因子等丝裂原刺激时被激活而被鉴定的，所以得名。所有的真核细胞都能表达MAPK。MAPK通路的基本组成是一种酵母到人类都保守的三级激酶模式，包括MAPK激酶激酶（MAP kinase kinase kinase，MKKK）、MAPK激酶（MAP kinase kinase，MKK）和MAPK，这三种激酶能逐级磷酸化激活，共同调节着细胞在生物体内的生长、分化、炎症反应、对环境的应激适应、等多种重要的细胞生理、病理过程[2-3]。近些年来，有关于植物MAPK的研究发展很快，有研究发现SlMPK1、SlMPK2及SlMPK3参与了Cf-4/Avr4诱导的过敏性反应，而且通过通过病毒的诱导基因沉默技术还发现SlMPK1和SlMPK3在抗叶酶病菌的反应中也起到了一定的作用，也有研究表SlMPK1参与番茄高温应答, 还有研究表明,SlMPAK3基因通过调节抗氧化系统酶活性和相关抗逆基因的转录来增强植株的低温抗性[4]。但是这些已经知道的番茄MAPK基因的功能只占了整个番茄MAPK基因家族的一小部分，大部分的番茄MAPK基因的功能目前任然尚不明确，，由于番茄在其开花结果期常常会遭遇到许多不良环境的影响（如高温[8]、低温[9]、盐渍[10]、干旱等）而导致严重影响到番茄的品质与产量，所以，研究番茄MAPK基因族与其表达特性及作用机理之间的关系对于增强番茄抗逆性等有着非常重要的意义，而番茄作为植物的一个模式生物，对于番茄MAPK基因族表达特性及作用机理的研究也对于研究整个植物圈的MAPK基因族的表达特性及作用机理具有着重要的意义。虽然近些年来有关于植物MAPK的研究发展得很快，但是与动物和酵母相比，我们对于MAPK在植物中的作用机制任然不是很清楚，所以，关于其基因家族的克隆分析及植物转化载体的构建，为我们研究MAPK在植物体内的作用机理及作用效果，提供了一个良好的基础，这也是本研究的一个重要意义。