1.材料与方法

1.1 实验仪器和试剂      

实验仪器：高压灭菌锅、超净工作台、离心机、pcr仪、冰箱、精密电子天平、移液枪、恒温水浴、电泳仪、电泳槽、恒温摇床、恒温培养箱等。

实验试剂：高保真酶、BP酶、LR酶、pDONOR207、35ss-GW-3HA、loading buffer、maker、甘油、琼脂糖、TAE缓冲液、蒸馏水、LB培养基、无水乙醇等。

所用引物对照表：

引物序号 引物序列 引物用途

L-111 GGGG ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCatggatgctgaaaacattgaaaatt

含有attB接头扩增SlMPK4基因

L-534 GGGG ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT tcacttggttgtatcgggatcaaac

L-048 TCGCGTTAACGCTAGCATGGATCTC 验证入门载体

L-049 GTAACATCAGAGATTTTGAGACAC

L-050 ACAATCCCACTATCCTTC 验证最终的表达

载体L-051 GACACACGAAATAAAGTAATC

LB固体培养基组成成分

试剂 含量

Tryptone 10g/L

Yeast Extract 5 g/L

Nacl 8 g/L

Agar 15 g/L

LB液体培养基组成成分

试剂 含量Tryptone 10g/LYeast Extract 5 g/L

Nacl 8 g/L

TAE缓冲液配方试剂 含量

Tris 242gNa2EDTA.2H2O 37.2 g

去离子水 800ml醋酸 57.1ml加去离子水定容到1L

1.2试验方法

1.2.1目的基因PCR扩增

  选用引物为L-111、L-534，选用模板为番茄cDNA    

PCR体系（50μl）：

试剂 含量模板DNA 0.5μlPrimer1 3μl

Primer2 3μlKAPA-HIFI酶 25μl

ddH2O 18.5μl

PCR反应的条件

95℃预变性3min,98℃变性15s,60℃退火30s,68℃延伸80s,扩增30个循环，延伸5min,冰箱保存。

1.2.2琼脂糖凝胶电泳检验

胶板制作：

琼脂糖干粉（g） TAE（ml） 染色剂(滴)

小胶 0.2 20 2

中胶 0.4 40 4

大胶 0.8 80 8

微波加热融化后倒入制胶器，冷却后取出胶板，放入电泳仪中进行点样，因为目的基因PCR产物无色所以其产物里应加入loading buffer进行点样，选用对照Maker标准为2K plus，电泳电压130V  电流130A。

1.2.3产物纯化

（1）PCR产物中加入DD溶胶液200微升。

（2）柱子中加100微升平衡液，离心2000rpm、30s。

（3）加入试剂WB漂洗600微升，离心1min(重复一次)。

（4）倒掉管中液体，柱子放回离心机中12000rpm离心2min.

（5）换1.5毫升EP管，开盖后放入烘箱1min，加入40微升EB（加中间），盖上盖后放烘箱3-5min.(孵化)。

（6）烘箱里拿出后在离心机12000rpm离心1min，柱子扔掉，产物放入-20℃冰箱保存。