我国在菊粉酶固定化方法、载体选择和应用的研究已经相当成熟，已经广泛应用于工业生产高果糖浆和乙醇等，而有关植物果聚糖外切水解酶研究相对较少，尤其是固定化工艺选择和应用，需要进一步探索。本实验选择Ci1-FEH IIA酶，采用D201阴离子大孔树脂法制作固定化酶，优化Ci1-FEH IIA酶固定化工艺。用固定化Ci1-FEH IIA酶水解菊芋块茎提取液生产果糖，探究工业生产果糖的最佳工艺，实现工业果糖生产低成本高效化。

1  材料与方法

1．1  实验材料与试剂

Ci1-FEH IIA酶(实验室)、D201大孔阴离子交换树脂(河北华众有限公司)、菊芋(南京农业大学牌楼)、菊粉(白银熙瑞生物工程有限公司)、浓硫酸、25%戊二醛溶液(国药集团化学试剂有限公司)、50mM醋酸醋酸钠缓冲溶液、DNS试剂(实验室)

1．2  实验仪器

酶标仪、摇床、恒温水浴锅、高效液相色谱(Agilent1200)、蒸发光检测器(Allteh ELSD3300)

1．3  方法

1．3．1  粗酶液处理    取一定体积Ci1-FEH IIA酶液，在冰水浴中每100mL加51.6g（80%）硫酸铵粉末，盐析沉淀过夜，离心后所得沉淀物为所需蛋白。

1．3．2  固定化酶制作工艺优化  

1．3．2．1  树脂预处理    蒸馏水多次洗涤称量好的树脂，直至异味消失。加入一定体积的2%氢氧化钠溶液，将量杯用保鲜膜封口，在常温下浸泡24小时后，再多次使用蒸馏水洗涤至中性。再倒入一定体积的5%盐酸溶液，再次浸泡24小时。最后，加入蒸馏水反复洗涤，直至液体呈中性。放置4℃冰箱备用。

1．3．2．2  最佳吸附温度    称取0.2g预处理好的树脂于离心管，加入0.1mL部分纯化酶液和2.9mL50mM pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲液，调制恒温水浴锅温度，使其分别为10℃、20℃、30℃、40℃、50℃和60℃，将离心管分别放入不同温度的水槽内吸附3h。冷却后，加入戊二醛溶液与上述混合液混匀，使其最终浓度为0.125%，在10℃恒温水浴锅内交联2h，用蒸馏水洗涤2~3次。DNS法测定酶活，确定最佳吸附温度。每组3个重复。

1．3．2．3  最佳吸附pH    称取0.2g预处理好的树脂于离心管中，分别加入pH为4.0、4.5、5.0、5.5和6.0的50mM醋酸-醋酸钠缓冲液2.9mL和0.1mL的部分纯化酶液，在上一步骤中测得的最适吸附温度下反应3h。冷却后，加入戊二醛溶液与上述混合液混匀，使其最终浓度为0.125%，在10℃恒温水浴锅内交联2h，用蒸馏水洗涤2~3次。DNS法测定固定化酶的活性，确定最佳吸附pH。每组3个重复。

1．3．2．4  最佳吸附时间    称取0.2g预处理好的树脂于离心管，加入0.1mL部分纯化酶液和2.9mL50mM以上测得最佳吸附pH值的醋酸-醋酸钠缓冲液，在最佳吸附温度下分别反应1h、2h、3h、4h、5h。冷却后，加入戊二醛溶液，使其与上述混合液混匀后最终浓度为0.125%，在不同温度下10℃交联2h，用蒸馏水洗涤2~3次。DNS法测定固定化酶的活性，确定最佳吸附时间。每组3个重复。

1．3．2．5  最佳戊二醛浓度    称取0.2g预处理好的树脂于离心管，加入0.1mL部分纯化酶液和2.9mL50mM以上测得最佳吸附pH值的醋酸-醋酸钠缓冲液。在最佳吸附温度下，吸附最佳时间。冷却后，添加若干体积的戊二醛溶液，与上述混合液摇匀，使其最终浓度分别为0.125%、0.25%、0.5%、1.0%，在10℃交联2h，用蒸馏水洗涤2~3次。DNS法测定固定化酶的活性，确定最佳戊二醛浓度。每组3个重复。

1．3．2．6  最佳交联温度    称取0.2g预处理好的树脂于离心管，加入0.1mL部分纯化酶液和2.9mL50mM以上测得最佳吸附pH值的醋酸-醋酸钠缓冲液。在最佳吸附温度下，反应最佳吸附时间。冷却后，加入戊二醛溶液与上述混合液混匀，使其最终浓度为最佳戊二醛浓度。使其分别在0℃、5℃、10℃、15℃、25℃下交联2h，用蒸馏水洗涤2~3次。DNS法测定固定化酶的活性，确定最佳交联温度。每组3个重复。