在我国，和缓艾美尔球虫分布很广[9]。但对和缓艾美耳球虫的研究却很少。可能因为和缓艾美耳球虫的形态大小与堆型艾美耳球虫相似[10]，其本身的致病力也较一般的球虫弱，所以以往常用的鉴定方法均不能起到很好的作用[11]。而当和缓艾美耳球虫与其他球虫混合感染时，和缓艾美耳球虫所引起的细微的肠道病理变化经常被其他球虫引起的病理变化及病症掩盖[12]。

研究和缓艾美耳球虫内生性发育及寄生部位不仅会给和缓艾美耳球虫的诊断带来许多方便，也是虫种鉴定工作的基础[13]。

1  材料与方法

1．1  材料

1．1．1  卵囊    

和缓艾美耳球虫孢子化卵囊（南京农业大学动物医学院兽医寄生虫学科组已分离，并经过鉴定，纯化及保存）。

1．1．2  实验动物    

两周龄海兰白雏公鸡60只。

1．2  方法

1．2．1  卵囊的扩增

1）实验前将收集卵囊所用工具（如离心杯、漏斗等）煮沸消毒。

2）在鸡粪加入纯净水，搅拌均匀，使粪液能顺利流过筛孔（不能过稀）。

3）过滤已搅拌均匀的粪液于入离心杯中，平衡每个离心杯的重量。

4）平衡后的离心杯置于低速大容量离心机离心（4000r/min）8min。

5）弃去上清，于离心杯中加入少量食盐，先倒入50mL饱和食盐水，充分搅拌，再倒入50mL饱和食盐水充分搅拌，平衡每个离心杯的重量。

6）将平衡后的离心杯置于低速大容量离心机离心（4000r/min）8min。

7）蘸取少量于显微镜下镜检，若观察到的虫卵数较少，弃去上清液，重复第5步、第6步。

8）当镜检到的虫卵数较多时，将上清液倒入干净的瓶中，加水稀释，确保可离心两次，配平每个离心杯的重量。平衡后的离心杯置于低速大容量离心机离心（4000r/min）8min。

9）弃去离心杯中的上清，先加入10mL2.5%重铬酸钾溶液，充分搅拌，再加入5mL重铬酸钾，确保无卵囊残留后倒入容器内，置入28℃温箱中孵育。

10）第二天观察孢子化情况。当孢子化率达到80%时，置4℃冰箱中保存。

1. 2. 2  实验动物分组方法    

试验雏鸡分为三组，分别为实验感染1组、实验感染2组和空白对照组，每组20只鸡。

1．2．3  孢子化卵囊的感染及鸡的饲养    

实验感染1组和实验感染2组中的鸡分别经口感染5×104个和缓艾美耳球虫孢子化卵囊，于空白对照组的鸡经口注入同等剂量的生理盐水。确保空白对照组与实验感染组的鸡不被其他球虫感染。

1．2．4  鸡只处死方法    

窒息致死。

1．2．5  鸡肠道样品的采集

实验感染组的鸡感染后于29、36、48、60、70、72、76、88、90、96、100、108、125、144、168、192、216、240小时后，分别剖杀一只实验感染1组、一只实验感染2组和一只空白对照组的鸡，打开腹腔并取出全部肠道。分别对三只鸡的十二指肠、卵黄囊憩室前10cm肠段、卵黄囊憩室后5cm肠段、盲肠盲端、直肠处取样1-2cm肠管。

实验感染1组和空白对照组的肠管样品用PBS缓冲液冲洗数次，冲洗干净管腔，置于10%多聚甲醛小瓶中固定，置于4℃冰箱中以备制片染色。

实验感染2组肠管样品用PBS缓冲液冲洗数次，冲洗干净管腔。刮取肠黏膜制作抹片并于显微镜下观察。同时将刮取后的试验鸡组和空白对照组的上述肠段冷冻保存，以备PCR鉴定。

在不同组鸡、不同时间段采样和清洗时所用的器材必须严格分开使用，以防相互污染。

1．2．6  肠道样品制片染色及观察    

肠道固定于10%多聚甲醛小瓶，包埋、制片，HE染色。置于显微镜下观察。