1. 2. 7  肠道组织DNA提取

   使用DNA提取试剂盒提取肠道组织的DNA。

1. 2. 8  肠道组织PCR扩增鉴定球虫种类

将所提取到的肠道组织DNA按不同部位、不同时间段分组用7种球虫的特异性引物（见表1）进行PCR扩增。

十二直肠：感染1组（29h、36h、48h、60h、70h、72h、76h、88h、90h）

感染2组（96h、100h、108h、125h、144h、168h、192h、216h、240h）

空白对照组（29h、48h、70h、76h、90h、100h、144h、192h、240h）

小肠中段：感染1组（29h、36h、48h、60h、70h、72h、76h、88h、90h）

感染2组（96h、100h、108h、125h、144h、168h、192h、216h、240h）

空白对照组（29h、48h、70h、76h、90h、100h、144h、192h、240h）

小肠后段：感染1组（29h、36h、48h、60h、70h、72h、76h、88h、90h）

感染2组（96h、100h、108h、125h、144h、168h、192h、216h、240h）

空白对照组（29h、48h、70h、76h、90h、100h、144h、192h、240h）

盲肠盲端：感染1组（29h、36h、48h、60h、70h、72h、76h、88h、90h）

感染2组（96h、100h、108h、125h、144h、168h、192h、216h、240h）

空白对照组（29h、48h、70h、76h、90h、100h、144h、192h、240h）

直肠：感染1组（29h、36h、48h、60h、70h、72h、76h、88h、90h）

感染2组（96h、100h、108h、125h、144h、168h、192h、216h、240h）

空白对照组（29h、48h、70h、76h、90h、100h、144h、192h、240h）

每组各取肠道组织DNA 10μL于1.5mL的EP管，充分混合，即为该组的肠道DNA。

分装为25μL的体系，每一体系含有12.5μL扩增酶mix、4μL肠道DNA、上下游引物各1μL、6.5μL双蒸水补足反应体系。所使用的引物见下图

表1  球虫鉴定用PCR扩增引物

Table 1  The primers of PCR amplification

球虫种类 ITS1特异性扩增引物序列（5’-3’） 扩增的碱基片段大小 退火温度

堆型艾美耳球虫 AATTTAGTCCATCGCAACCCT

CGAGCGCTCTGCATACGACA 145bp 65℃

布氏艾美耳球虫 TACATCCCAATCTTTGAATCG

GGCATACTAGCTTCGAGCAAC 310bp 45℃

巨型艾美耳球虫 GTGGGACTGTGGTGATGGGG

ACCAGCATGCGCTCACAACCC 205bp 65℃

和缓艾美耳球虫 GGCTTGGATGATGTTTGCTG

CGAACGCAATAACACACGCT 330bp 65℃

毒害艾美耳球虫 CATCATCGGGAATGGCTTTTTGA

AATAAATAGCGCAAAATTAAGCA 285bp 44℃

早熟艾美耳球虫 TATTTCCTGTCGTCGTCTCGC

GTATGCAAGAGAGAATCGGGA 215bp 65℃

柔嫩艾美耳球虫 GATCAGTTTGAGCAAACCTTCG

TGGTCTTCCGTACGTCGGAT 271bp 65℃

PCR反应条件：94℃ 5min；94℃ 30s，65℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min            

1. 2. 9  肠道组织PCR鉴定

1）称取0.6g的琼脂糖，用60ml的0.5×TAE电泳液配置成1%的琼脂糖，煮沸。

2）煮沸后冷却至60℃左右，加入6μL的核酸染料。

3）DL500 DNA Marker每孔加5μL，PCR产物每孔加10μL。

4）设置参数，盖上槽盖，接通电源开始跑胶。

5）将凝胶捞出进行凝胶成像。

2  结果与分析                                                            

2．1  肠道抹片观察结果

镜检显示：

感染后36小时可见游离的第一代裂殖子，位于卵黄囊憩室前10cm肠段的肠黏膜抹片中（图1）。

感染后48小时可见游离的第一代裂殖子，位于在卵黄囊憩室后5cm肠段的肠黏膜抹片中（图2）。

感染后60小时即可在所有肠段的肠黏膜抹片发现游离的裂殖子（图3、图4、图5）。

感染后100小时于卵黄囊憩室前10cm肠段的肠黏膜抹片中发现了卵囊（图6）。

感染后108小时在卵黄囊憩室后5cm肠段和盲肠盲端的肠黏膜抹片中可发现卵囊