摘要：禽流感病毒（AIVs）变异极快，亚型众多，在防控上存在极大困难，所以目前应加强AIVs在致病机理、跨宿主传播等机制方面的研究，加快新型禽流感疫苗的研制和抗流感药物的开发。目前，反向遗传学技术已被广泛用于AIVs复制机制和致病机理的研究。本研究对H9N2  AIVs NJ01株的全基因组进行了序列测定和遗传进化分析，并对其8个因片段（PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、NS、M）进行了保真克隆。遗传进化分析结果显示，NJ01病毒的PB2、PB1、PA、HA、NA、NP、M基因均处于A/chicken/Shanghai/F/98-like分支，而NS基因处于A/Duck/HongKong/Y439/97-like分支。；基因克隆和测序结果显示，我们获得了NJ01病毒8个基因片段的保真克隆。以上结果为H9N2 AIVs反向遗传操作系统的建立奠定了实验基础。

关键词： H9N2；NJ01株；序列分析；载体构建；

Whole-genome Sequence Analysis and Fidelity Cloning of H9N2 Subtype Avian Influenza Virus NJ01 Strain

Abstract：Avian influenza viruses(AIVs) have many subtypes and are prone to variability. The characteristics pose great difficulties for prevention and control. Therefore, it is imperative to strengthen the research on pathogenic mechanisms, cross-host transmission, and accelerate the development of new influenza vaccines and Anti-influenza drugs. Currently, Reverse genetics technology has been widely used in the study of AIVs replication mechanism and pathogenic mechanism. In this study, the whole genome of H9N2 subtype avian influenza virus (AIVs) NJ01 strain was sequenced and phylogenetically analyzed, and fidelity cloning of whole gene fragments (PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, NS, M) was performed. The results of genetic evolution analysis show that the PB2, PB1, PA, HA, NA, NP and M genes of the virus were in the A/chicken/Shanghai/F/98-like branch, while the NS gene was in the A/Duck/HongKong/Y439/97-like Branches. The gene cloning and sequencing results showed that we obtained the fidelity clones of 8 gene fragments of NJ01 virus. The above results lay the foundation for the establishment of H9N2 AIVs reverse genetics operating system.

Key words: H9N2; NJ01 strain; Sequence analysis; Vector construction;

目  录

摘要2

关键词2

Abstract2

Key words2

引言2

1材料与方法3

1.1材料 3

1.1.1 毒株、载体及菌种3

1.1.2 主要试剂3

1.1.3 常用培养基和缓冲液3

1.1.4 主要仪器3

1.2方法 3

1.2.1引物设计与合成3

1.2.2 H9N2亚型禽流感病毒NJ01株病毒的复壮与增殖4

1.2.3 H9N2亚型禽流感病毒NJ01株RNA的提取及cDNA的获取5

1.2.4目的片段的扩增与纯化5

1.2.5重组质粒的构建和筛选6

1.2.6 重组质粒的鉴定6

1.2.7 基因序列分析7

2结果与分析7

2.1 H9N2亚型禽流感病毒NJ01株病毒血凝价测定结果7

2.2目的基因RT-PCR扩增结果7

2.3蓝白斑筛选及菌液PCR鉴定结果7

2.4重组阳性质粒测序鉴定结果 9

2.5目的基因序列分析9

2.5.1 HA基因分析9

2.5.2 NA基因分析10

2.5.3 PA、PB1、PB2基因分析 11

2.5.4 NS、NP、M基因分析13

3讨论 15

致谢16

参考文献16

H9N2亚型禽流感病毒NJ01株全基因序列分析及保真片段克隆

禽流感（avian influenza）是由正黏病毒科禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）引起的野鸟和家禽等发病的一种高度接触性传染病[1]。禽流感病毒属分节段的单股负链RNA病毒1，基因组约13.6kb，可分为8个大小不等的独立片段1。这8个基因片段分别编码流感病毒的7个结构蛋白（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M）和1个非结构蛋白（NS）。根据流感病毒核蛋白（NP）的高度保守性[2]，流感病毒也可分为A、B、C三型。其中危害最为严重属A 型流感病毒，除感染人类外3，还常感染其它的哺乳动物和鸟类[3]，并且极易发生变异，甚至引起世界范围内的流感大流行，对人类的健康和畜牧业发展打击重大。AIV血清型众多，近年来也一直在不断发现新的亚型，至目前1，AIV已发现有18个血凝素（HA）亚型和11个神经氨酸酶（NA）亚型1，其中H17N10 和H18N11仅在蝙蝠中分离鉴定到[4-5]1,。在我国许多省份的禽类中，H9N2亚型流行最为广泛1。禽流感自1966年被发现以来，已给世界各国的养禽业造成了巨大的经济损失9，严重危害农业和养禽业的可持续发展[6]，因此全世界都在致力于该病毒的基础研究1。相对于经典遗传学而言，反向遗传学是直接在生物遗传物质的基础上1，即在目的基因的高保真克隆片段载体上1，通过对靶基因进行一系列分子水平操作1，来研究生物体基因组的结构1、功能及生命的本质现象[7]。随着此技术的兴起和发展，其在对流感病毒的复制机制、调控机理、致病性研究和新型疫苗制备等各项工作中显示出独特的作用[8]。本研究对H9N2 AIVs NJ01株全基因组进行序列测定和遗传进化分析，对比近年来H9N2 AIVs毒株的核苷酸序列和氨基酸序列，构建进化树，并对其特殊位点进行分析，了解H9N2进化的过程[9-10]。同时，对H9N2 AIVs NJ01株的8个基因片段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、NS、M）的保真克隆9，是H9N2 AIVs NJ01株反向遗传操作系统建立的基础0，为H9N2 AIVs NJ01株后续的病毒拯救及基因定向改造提供实验基础1。