1）收集样品200μL，转入1.5mL EP管中，若样品中有细胞或细菌的污染1，可先12000×g离心5min，取上清200μL作为样品。

2）加入200μL Buffer V-L，漩涡震荡混合均匀，静置5min1。

3）加75μL Buffer V-N，漩涡震荡混合均匀，12000×g离心5min1。

4）将上清转移到2mL EP管中，加入300μL异丙醇（确保已加入1%冰醋酸），并上下倒置6-8次，充分混合均匀1。

5）将制备管置于2mL EP管中1，吸取步骤4中的混合液移入到制备管中1，6000×g离心1min1。

6）弃滤液，将制备管置回到2mL EP管中1，加500μL Buffer W1A，室温静置1min。12000×g离心1min。Buffer W1Aconcentrate中确认已按照试剂瓶上制定的体积加入无水乙醇。

7）弃滤液1，将制备管置回2ml EP管中0，加800μL Buffer W22， 12000×g离心1min1。Buffer W2 concentrate中确认已按照试剂瓶上标注的体积加入无水乙醇。

8）将制备管置回2mL EP管中11，12000×g离心1min1。

9）将制备管置于洁净的1.5mL EP管中，在制备管的膜中央加40-60μL Buffer TE（无核酸酶），室温静置1min1。12000×g离心1min1洗脱RNA1。

RNA提取完成后立即进行反转录获得cDNA。体系为（50μL）：

5×RT buffer 10μL

RNasin 1.5μL

10mMdNTPs 4μL

AMV反转录酶 2μL

RNA   28.5μL

Uni-12随机引物 4μL

瞬时离心，42℃作用2h，得cDNA模板，于-20℃冻存。

1.2.4 目的片段的扩增与纯化  

以反转录所得的cDNA为模板，分别扩增PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因全长，体系为（50μL）：

程序为：94℃预变性2min1；进入第一个循环程序：94℃ 30s，52℃ 45s，72℃延伸2min1，共15个循环；完成后进入第二个循环程序：94℃ 30s，58℃ 45s，72℃延伸2min1，共25个循环，最后72℃延伸7min1，PCR程序结束。待PCR仪降至4℃取出样品，每管加入10μL 6×Loading Buffer进行0.1%琼脂糖凝胶电泳，并按照Axygen DNA Gel Extraction Kit说明书回收目的片段。具体操作如下：

1）紫外灯下将含有目的基因的琼脂糖凝胶块切下1，擦净胶块表面液体及碎屑，计算凝胶重量（减去1.5mL EP管的重量），将此重量记录为一个凝胶体积（例：100mg=100μL体积）。

2）加入三倍凝胶体积的Buffer DE-A溶液，混合均匀后75℃水浴加热，每2-3min混合一次，约6-8min1后凝胶块完全融化，形成均一紫红色液体。

3）加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B溶液，上下倒置，混合均匀，形成均一的黄色溶液。

4）将步骤3中的混合液，吸取到DNA制备管（置于2mL EP管）中，12000×g离心1min，弃滤液1。

5）将制备管置回2mL EP管中，加入500μL Buffer W1溶液， 12000×g离心1min1，弃滤液1。

6）将制备管置回2mL EP管中，加700μL Buffer W2溶液， 12000×g离心30s，弃滤液1。再次用700μL Buffer W2溶液洗涤一次，12000×g离心1min1，弃滤液1。Buffer W2 concentrate中确认已按照试剂瓶上标注的体积加入无水乙醇。

7）将制备管置回2mL EP管中，12000×g离心1min1。

8）将制备管置于洁净的1.5mL EP管中，在制备管膜中央加25-30μL Eluent（去离子水也可），室温静置1min1。12000×g离心1min1，洗脱DNA1。所得胶回收DNA保存于-20℃。