1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、载体及菌种

H9N2亚型禽流感病毒（AIVs）NJ01株由江苏省农业科学院兽医研究所禽病研究室分离保存。PMD18-T、PMD20-T购自宝生物工程（大连）有限公司，E coli.DH5α感受态细胞购自宝生物工程（大连）有限公司和南京诺维赞生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂

Reverse Transcriptase XL (AMV)、Recombinant Rnase Inhibitor (PRI)、10mM dNTP Mixture、2.5mM dNTP Mixture、25mMgCl2、10×E×Taq buffer、E×Taq酶、PMD18-T Vector Cloning Kit购自宝生物工程（大连）有限公司，DL2000 DNA Marker购自DSBIO生物公司，氨苄青霉素，核酸染料购自上海蒲迪生物公司，Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit 、DNA Gel Extraction Kit、Plasmid Miniprep Kit购自康宁生命科学有限公司。

1.1.3 常用培养基和缓冲液  

LB固体培养基（2.5% LB Broth，1.5% agarose），LB液体培养基（2.5% LB Broth），TAE电泳缓冲液（40mM Tris-醋酸，2mM EDTA，定容至1L）

1.1.4 主要仪器

-80℃超低温冰箱(Thermo)、超高速低温离心机(Eppendorf)、水浴锅（一恒科技）、Gradient PCR(Takala)、核酸凝胶电泳系统（南大普阳）、核酸凝胶成像系统、37℃恒温培养箱（上海光都仪器制品有限公司）、37℃摇床（华美生化仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

从GenBank中查找公布的H9N2亚型流感病毒的5'和3'末端保守序列，参考相关文献，进行比对[11]，利用Oligo 7软件和Primer Premier 5软件设计合成流感病毒PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS基因的扩增引物及流感病毒反转录通用引物Uni-12。引物由金斯瑞（南京）生物科技有限公司检验并合成送回1。

表1 所用引物名称

引物名称* 序列 (5'to3')*

Uni-12

Ba-PB2-F

Ba-PB2-M-R

Ba-PB2-M-F AGCGAAAGCAGG

TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTC

ATGGGTTCAATTCCCCAGTT

GGCAACCTCCAAACATTGA

Ba-PB2-R ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT

Bm-PB1-F TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCA

Bm-PB1-M-R ATATCGTCTCTCAACATGTTGAACATGCCCATC

Bm-PB1-M-F TATTCGTCTCTGTTGAGTACAGTCTTAGGAGTC

Bm-PB1-R ATA TCGTCTCGTATTAGTAGA AACAAGGCATTT

Ar-PA-F TATTCACCTGCCAGAGGGAGCGAAAGCAGGTAC

Ar-PA-M-R ATATCACCTGCGATCCAACATGCTAGTGATCTGG

Ar-PA-M-F TATTCACCTGCGCATGTTGGATCCAGAATG

Ar-PA-R ATATCACCTGCTCAGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT

Hin-HA-FHA-M-RHA-M-F TATTAAGCTTAGGGAGCAAAAGCAGGGG

TGTGGAACGGCAATGTGGTGT

GGCCAAGGCCCCTTGTCAAT

Xho-HA-R ATATCTCGAGGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT

Ba-NP-F TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTA

Ba-NP-R ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT

Hin-NA-F TATTAAGCTTAGGGAGCAAAAGCAGGAGT

Xho-NA-R ATATCTCGAGGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT

Bm-M-F TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG

Bm-M-R ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT

Bm-NS-F TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG

Bm-NS-R ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT

1.2.2 H9N2亚型禽流感病毒NJ01株病毒的复壮与增殖

取5只9-11日龄的SPF鸡胚分别标记1-5，,并对其进行病毒接种，每日观察鸡胚生长情况并从死亡鸡胚中收取尿囊液，22μm滤器过滤后分装，每组取25μL进行血凝试验，剩余尿囊液于-20℃冻存。根据血凝试验的结果选取血凝价最高的一组，用作本次H9N2  AIVs NJ01株的样品进行RNA提取。血凝试验操作如下：在96孔板的1-11孔中分别加入25μL生理盐水，加满5排，标记1-5。分别吸取25μL尿囊液于第一列的对应孔中并吹打混合均匀，然后从第一列孔中吸取25μL于第二列孔中吹打均匀，依次倍比稀释到第10孔，吸弃25μL。在最后一列的五孔中加入25μL尿囊液，作为阳性对照。每孔中加入1%的红细胞25μL，轻轻震荡并于室温静置10-30分钟，观察结果。

1.2.3 H9N2亚型禽流感病毒NJ01株病毒RNA的提取及cDNA的获取

根据Axygen Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit说明书进行流感病毒总RNA的提取1：