1. 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试材

中高温大曲：取自河南宋河酒业股份有限公司。

1.1.2 主要培养基

牛肉膏蛋白胨培养基[13]：牛肉膏 3 g，蛋白胨 10 g，氯化钠 5 g，琼脂粉 20 g，水1000 mL，pH自然。

发酵培养基[14]：葡萄糖 10 g，蛋白胨 10 g，磷酸氢二钾 1.0 g，硫酸镁 0.3 g，硫酸亚铁 0.01 g，氯化钾 0.5 g，硫酸锰 0.3 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4-7.6。

筛选培养基[14]： 发酵培养基加0.4%的三丁酸甘油酯，2%的琼脂粉。

糖发酵基础培养基[15]：蛋白胨 10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.4，每100 mL培养基中加入1.6%的溴甲酚紫1 mL。

葡萄糖水蛋白胨培养基[13]：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，磷酸氢二钾 2 g，水1000mL，pH 7.0-7.2。

培养基灭菌条件均为高压湿热灭菌121℃，20 min。

1.1.3 仪器设备

JJ-CJ-2FD型洁净工作台（苏州市金净净化设备科技有限公司），PL203型电子天平（博特勒-托利多仪器（上海）有限公司），LDZX-75KB型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），DHP-9272型电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），H1850R型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），ZHWY-2102型恒温培养摇床（金坛市精达仪器制造有限公司），PHS-3E型pH计（上海佑科仪器表有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 产酯化酶菌株的分离与筛选

1.2.1.1 分离与初筛

无菌条件下称取10 g大曲粉入90 mL无菌水三角瓶中，加玻璃珠数颗，置电炉加热至沸腾，保持10 min，以富集芽孢菌。三角瓶冷却后，在37℃、140 r/min条件下振荡30 min，静置，取1 mL上清液于9 mL无菌水中，以此做梯度稀释至10-7。分别取10-5、10-6、10-7稀释度的菌悬液0.2 mL均匀涂布于平板筛选培养基上，37℃培养24-48 h。观察菌落周围的透明圈情况，挑选有透明圈且有特征的单菌落进行编号、分离纯化至纯种，试管斜面保藏备用。

将纯菌株用无菌枪头点种在筛选培养基上，37℃培养 48 h，测量菌落直径（d）与透明圈的直径（D），并计算D/d值，比值大者为初筛菌株。

1.2.1.2 复筛

   选择初筛菌株进行摇瓶发酵复筛。挑取三环菌落于30 mL发酵培养基中，37℃，140 r/min摇瓶培养15小时制备成种子液。取种子液1 mL加入20 mL液体发酵培养基中，37℃，140 r/min培养3 d，测定粗酶液酯化酶活力，酶活力高者为复筛菌株，每个样品重复两次。

1.2.2 复筛菌株的发酵条件优化

以酯化酶活力测定为指标，分别设计单因素试验与正交试验，研究不同发酵时间（2d、3d、4d、5d）、不同碳源（玉米粉、淀粉、葡萄糖、麸皮、蔗糖）、不同氮源（黄豆粉、硝酸铵、蛋白胨、尿素）、不同发酵温度（37℃、42℃、47℃、52℃、57℃）、不同发酵初始pH值（5、6、7、8、9）对复筛菌株产酶发酵条件的影响，并选择最优的产酶发酵条件。

1.2.3 菌种鉴定

1.2.3.1 形态学鉴定

   观察复筛菌种的菌落特征，主要包括菌落形状、边缘、颜色及透明程度、湿润程度等。并对菌株进行革兰氏染色，镜检染色结果及芽孢特征[13,16]。

1.2.3.3 生理生化特性测定

芽孢菌的测定生理生化特性项目主要包括过氧化氢酶试验、V.P试验、耐盐性试验（2%、5%、7%）、耐酸性试验（pH5.7）、淀粉水解试验、糖发酵试验（葡萄糖、阿拉丁糖、木糖、甘露糖）等[13,16]。

1.2.3.4 种属鉴定

   结合菌落特征、镜检细胞形态及生理生化特性，参照张纪忠微生物分类学进行菌株的种属鉴定[17]。

1.2.4 酯化酶活力的测定

取发酵液1 mL，6000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液，酯化酶活力的测定参考黄丹等方法[18]。酶活力单位定义[19]：在测定条件下每分钟消耗lμmol己酸所需要的酶量为1个酶活力单位。