CRED技术(偶联限制性内切酶酶切-随机扩增）是在1996年由美国佛罗里达大学的三名研究者（CaiQin yin,CharlesL.Guy和GloriaA.Moore）在双酶切消化和DNA随机扩增两大原理上共同研究的检测DNA甲基化的方法。其基本原理为：很多的限制性核酸内切酶在它的目标位点上对胞嘧啶甲基化的敏感性不同,如果在它的识别序列上的某一特定的胞嘧啶被甲基化,那么它的酶切功能就会受到抑制[16]。利用一对同裂酶（Hpa II 和 Msp I）的酶切产物来进行PCR，由此可以检测出相应位点上是否发生了甲基化以及发生了何种甲基化[17]。本文通过CRED检测la3+对小麦根尖DNA甲基化程度的影响，为相关稀土元素对植物的作用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及药品

  北京农科院提供京-17品系小麦种子；lacl3（10mM）母液；DNA提取试剂盒（康为世纪生物公司），HPAII、MSPI内切酶(Takara)。

1.2 实验方法

1.2.1 小麦种子萌发及生根处理

选取大小相近、颗粒饱满的小麦种子用蒸馏水浸泡吸涨2小时后，放在铺有用蒸馏水润湿的滤纸的直径10厘米的培养皿中，于25℃恒温培养箱中避光培养。挑选萌发露白1毫米左右的种子分别放入铺有用蒸馏水和0.5 mM、1.0 mM、1.5 mM浓度LaCl3溶液浸湿的滤纸上22℃避光培养24小时。

1.2.2 根长统计    

分别测量CK、0.5 mM、1.0 mM、1.5mM、2.0mM组的小麦主根长，详实记录。并用Graph 5软件作图并分析差异。

1.2.3 DNA提取

选择与对照组差异明显的浓度处理组，采用DNA提取试剂盒，按说明分别提取CK和选取组的DNA。采用植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪公司，货号为CW0553）。方法如下：

（l）取小麦新鲜根尖约0.1g，加入液氮充分研磨；

（2）将研磨后的粉末收集到离心管中，加入700μL65℃预热的Buffer GP1（使用前在预热的Buffer GPI中加入β-巯基乙醇，终浓度为0.1％），迅速颠倒混匀后，将离心管置于65℃水浴20min,水浴过程中颠倒离心管混匀样品数次；

（3）加入4μL 100mml的RNase溶液，震荡15s，室温放置2min;

（4）加入700μL氯仿，充分混匀，1200rpm离心5min；

（5）将上层水相转入一新离心管中，加入700μL Buffer GP2，充分混匀；

（6）将上一步所得溶液全部加入吸附柱中，12000rpm离心30s，弃废液。将吸附柱放回收集管中，如不能一次将所有溶液转入，可分两次进行；

（7）向吸附柱中加入700μL Buffer GWl（使用前检查是否已加无水乙醇），12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

（8）向吸附柱中加入500μL Buffer GW2（使用前检查是否已加无水乙醇），12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

（9）重复步骤8；

（10）12000rpm离心2min,弃废液。吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的Buffer GW2：

（11）将吸附柱放到一个新离心管中，加入50-200μL Buffer GE，室温放置2-5min，12000rpm离心1min,收集DNA溶液．一20℃保存DNA。