摘要：本试验以哥伦比亚野生型（WT、Col-0）和拟南芥RNAi突变体作为试验材料，（1）通过前期预试验对Col-0进行无菌苗Cd2+胁迫处理，从而制定出拟南芥耐受氯化镉胁迫的最适极限浓度；（2）在同一Cd2+胁迫浓度下，同时对Col-0和拟南芥RNAi突变体库分别进行筛选，得到耐受Cd2+的RNAi突变体拟南芥单株；（3）分别对RNAi突变体拟南芥单株和Col-0进行基因组DNA提取，通过特异引物进行PCR，从突变体单株DNA中扩增出目的基因片段，测序并进行其碱基和氨基酸特征分析，将该基因命名为T350：（4）对T350基因的过表达和RNAi株系进行纯合筛选，通过分析其在Cd2+耐受方面的功能，对纯合子进行Cd2+及其他相关胁迫处理，验证其基因功能，结果表明，RNAi突变体可以增强对重金属Cd、Pb以及干旱、盐渍胁迫能力。

关键词：拟南芥；RNAi突变体库；基因功能；镉胁迫

The clone and functional analysis of a gene response to Cd stress

Abstract:In this study, Columbia wild type (WT, Col-0) and RNAi mutant of Arabidopsis thaliana was used as the test material . (1) The optimum concentration of Cd2+ was obtained by the treatment of Col-2 seedlings;(2)the arabidopsis that are of the tolerance of Cd2+ was obtained from the screening of Cd2+treatment to the WT and RNAi Arabidopsis; (3)the gene we named as t350 was cloned from the mutant plants by specific primers was sequenced and the feature of the amino acid was analyses; (4)the function of the gene was validated by the tolerance of Cd2+ and other related stress of over expression and homozygous.The results shows that the tolerance of heavy metal ,drought and salt was enhanced in rnai mutants.

Key words: Arabidopsis thaliana; RNAi mutant library; gene functions; cadmium stress

目录

摘要 1

关键词 1

引言 1

1材料和方法 2

1.1实验材料 2

1.2试验方法 3

1.2.1耐受极限重金属镉拟南芥RNAi突变体（homozygote）的筛选 3

1.2.2拟南芥耐极限重金属镉目的基因的克隆 3

1.2.3抗性拟南芥基因功能分析 3

2结果与分析 4

2.1筛选耐重金属镉的极限浓度 4

2.2扩增目的基因片段 4

2.3非生物胁迫下基因功能验证和at234突变体植株表型分析 5

2.3.1重金属盐氯化镉胁迫 5

2.3.2重金属盐硝酸铅胁迫 6

2.3.3人为模拟干旱胁迫 6

2.3.4氯化钠高盐胁迫 6

2.3.5非生物胁迫下拟南芥植株生长和生理特性的影响 7

3讨论 10

参考文献 11

致谢 13

一个调控拟南芥镉胁迫的基因克隆及功能分析

引言

重金属具有长期性、积累性、不可逆性、潜伏性、危害大、治理成本高等污染特点。重金属污染的程度，将直接影响到人类尤其是未成年人的健康和安全。作为重金属矿产资源开采、冶炼加工的河南大省，重金属污染的历史包袱依旧沉重[1]。目前河南省部分区域的土壤污染状况不可小觑，主要污染物为镉、铅和有机氯农药[2]。其中镉（Cd）是重金属毒害中毒性最大的金属离子之一，对动植物的生长发育有很大的危害，也很容易引起人类健康的各种问题。1972年，联合国粮农组织（FAO）与世界卫生组织（WTO）联合专家委员会在对于食品污染毒性报告中指出，Cd的食品污染物毒害性位居第三位，是仅次于黄曲霉毒素和砷的食品污染物[3]。1984年，联合国环境规划署提出的12种具有全球意义的危害物质中，Cd位列第一，并于1993年被正式确定为致癌物质[4]。

虽然世界各国已经意识到了问题的严重性，相关重金属Cd污染的清除治理工作已经陆续开展，但收效甚微。主要是因为土壤中重金属Cd的清除技术限制，使得土壤中的重金属Cd无法实现高效、彻底地的清除。例如，使用石灰改良、化学淋洗等理化方法来清除土壤中的重金属，不仅存在成本高，而且还有破坏土壤结构的缺陷，使得其应用价值大大降低，无法大规模推广使用[5]。因此，各国已经开始将注意力转向生物修复技术的发展。利用能在重金属Cd环境中生长，并能超积累或低吸收重金属Cd的转基因植物，对于土壤重金属Cd污染的治理，以及提高作物的安全性具有重要的意义[6]。植物基因在特定时间空间的选择性表达决定了植物的生长、发育、凋亡和其他生命活动，包括应力的适应。也就是说，在植物受到环境因子的刺激时，植物的基因调控的表达会发生改变，包括某些蛋白质结构的变化，其他酶的产生和其他特殊物质的变化。这是发生在植物本身是适用于结构的应力和代谢调节[7-8]。因此，只有通过了解植物编码的重金属耐受蛋白基因及其表达产物，才能正确理解植物对重金属的抗性机制，并对其在人类生产生活中的潜在作用和生存起重要作用[9]。目前，河南省政府主要用于超富集植物和固定稳定化剂，植物中重金属含量较低，适用本地栽培，对轻微污染和轻度污染的土壤进行安全利用[10-14]。